| Περίληψη |
Περίπου 4000 ανθρώπινες ασθένειες έχουν σχετιστεί με γενετικές ανωμαλίες μέχρι στιγμής (1). Οι περισσότερες από αυτές είναι απειλητικές για την ζωή των ασθενών και επηρεάζουν όλες τις πτυχές της ζωής τους σε καθημερινή βάση. Ο μόνος τρόπος να εξαλείψει κανείς μια γενετική ασθένεια είναι να την θεραπεύσει στη ρίζα της. Η γονιδιακή θεραπεία είναι μια πειραματική τεχνική, η οποία λειτουργεί σε αυτή την κατεύθυνση χρησιμοποιώντας διαφορετικές προσεγγίσεις, οι οποίες περιλαμβάνουν την αντικατάσταση ή την "σίγαση" ενός μεταλλαγμένου γονιδίου και την εισαγωγή ενός καινούργιου. Η ενδοκυτταρική μεταφορά γεννετικού υλικού είναι ευρέως γνωστή ως "διαμόλυνση" (transfection) και πραγματοποιείται με την χρήση ιών και μη.
Η μεταφορά γονιδίων σε ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας μεθόδους που δεν περιλαμβάνουν τη χρήση ιών έχει γίνει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση στη γονιδιακή θεραπεία τα τελευταία χρόνια (2). Ένα από τα τρέχοντα εμπόδια στην επιτυχή γονιδιακή θεραπεία είναι η ανεπαρκής μεταφορά του διορθωτικού γονιδίου στα στοχευμένα κύτταρα. Νέες μέθοδοι απαιτούνται για την μεταφορά νουκλεϊκών οξέων σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων αποτελεσματικά και με υψηλές αποδόσεις.
Σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε την ανάπτυξη μιας καινοτόμας πλατφόρμας μεταφοράς για διαμόλυνση κυττάρων in vitro, αποτελούμενη από συστοιχίες κάθετα προσανατολισμένων νανοσυρμάτων πυριτίου (VA-SiNWs) κωνικού προφίλ, τα οποία ονομάστηκαν "μικρο-κωνικές ακίδες πυριτίου". Η κατασκευή ξεκινά με την αυτοδιάταξη (self-assembly) μιας εξαγωνικής συμπυκνωμένης δυσδιάστατης συστοιχίας νανοσφαιρών πολυστυρενίου πάνω σε μια μεγάλη επιφάνεια πυριτίου μέσω επαγωγικής διάταξης (convective assembly). Η προκύπτουσα μονοστρωματική εξαγωνική συμπυκνωμένη συστοιχία των νανοσφαιρών πολυστυρενίου μετατρέπεται σε μη συμπυκνωμένες συστοιχίες μέσω εγχάραξης (etching) με πλάσμα οξυγόνου. Οι εγχαραγμένες νανοσφαίρες πολυστυρενίου λειτουργούν έπειτα σαν μάσκα για την βαθιά εγχάραξη μέσω ενεργών ιόντων του πυριτίου χρησιμοποιώντας την διαδικασία "Bosch". Το τελευταίο βήμα στην κατασκευή των μικρο-κωνικών ακίδων πυριτίου είναι η διαμόρφωση μιας πιο λείας και αιχμηρής μορφολογίας χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό θερμικής οξείδωσης και υγρής εγχάραξης.
Οι συστοιχίες αυτές μικρο-κωνικών ακίδων πυριτίου, ταξινομήθηκαν σε τρεις κατηγορίες, με βάση το ύψος των ακίδων, εμφανίζοντας μια ποικιλία αρχιτεκτονικών (Πίνακας 4.2) και χρησιμοποιήθηκαν μαζί με επίπεδο πυρίτιο σε in vitro κυτταρικές καλλιέργειες χρησιμοποιώντας σαν μοντέλο την κυτταρική σειρά ΗΕΚ293 (εμβρυονικά ανθρώπινα νεφρικά κύτταρα). Έπειτα από την λειτουργικοποίηση της επιφάνειας των συστοιχιών μικρο-κωνικών ακίδων με πλασμίδιο που έχει κωδικοποιημένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, πραγματοποιήθηκε η μεταφορά του πλασμιδίου με μηχανική διείσδυση χρησιμοποιώντας την φυγόκεντρο, με τις ακίδες στραμμένες προς τα κύτταρα (Μέθοδος Μεταφοράς 1). Ένα τέτοιο σύστημα μεταφοράς μπορεί να μας προσφέρει δύο κύρια πλεονεκτήματα: γρήγορη και παράλλη μεταφορά του πλασμιδίου σε μια μεγάλη ποσότητα κυττάρων. Πριν προχωρήσουμε στα πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων, εξετάσαμε την βιωσιμότητα αυτών κατά την διάρκεια της επαφής τους με τις μικρο-κωνικές ακίδες καθώς και την ύπαρξη ή όχι διείσδυσης αυτών στο κυτταρόπλασμα μέσω της κυτταρικής μεμβράνης με την βοήθεια FIB-SEM.
Τα πειράματα βιωσιμότητας των κυττάρων έδειξαν πως μια παρατεταμένη (για μερικές ώρες) επώαση της όλης προαναφερθείσας διάταξης οδηγεί σταδιακά στο θάνατο των κυττάρων και στις δύο περιπτώσεις. Τόσο στο ίχνος που αφήνουν οι μικρο-κωνικές ακίδες, μετά την αφαίρεσή τους, στα πηγάδια καλλιέργειας αλλά και στην ίδια την επιφάνεια των ακίδων. Αυτό πιθανά αποδίδεται στην έλλειψη οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών που ήταν διαθέσιμα στα κύτταρα κατά την επαφή. Παρ’όλα αυτά όμως, μια σύντομη επώαση (το πολύ 30 λεπτών) αφήνει όλα τα κύτταρα ζωντανά. Επιπλέον η παραμονή προσκολλημένων κυττάρων στην επιφάνεια των πηγαδιών καλλιέργειας, μας αφήνει το ενδεχόμενο να επιτύχουμε διαμόλυνση των κυττάρων και στα πηγάδια καλλιέργειας.
Όσον αφορά την απεικόνιση με FIB-SEM, οι εικόνες φθορισμού που πήραμε αποκάλυψαν την επιτυχή διείσδυση των μικρο-κωνκών ακίδων, όλων των χαρακτηριστικών, στο κυτταρόπλασμα μέσα σε 15 και 30 λεπτά επώασης αντίστοιχα. Αυτή είναι μια καλή αλλά όχι επαρκής ένδειξη πως θα έχουμε και διαμόλυνση των κυττάρων.
Τέλος, προχωρήσαμε σε πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων για να εξετάσουμε την αποτελεσματικότητα του συστήματος μεταφοράς μας. Για συγκριτικούς λόγους, πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με την χρήση και μιας επιπλέον μεθόδου (τα κύτταρα πάνω από τις μικρο-κωνικές ακίδες – Μέθοδος Μεταφοράς 2) ακολουθώντας ένα παρόμοιο πρωτόκολλο. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι είχαμε διαμόλυνση των κυττάρων με την χρήση και των δύο μεθόδων μεταφοράς. Τα διαμολυσμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν στην επιφάνεια των συστοιχιών από μικρο-κωνικές ακίδες και κυρίως σε εκείνες που αποτελούνταν από ταυτόχρονα υψηλότερες και αιχμηρότερες ακίδες. Παρ’όλα αυτά, κανένα διαμολυσμένο κύτταρο δεν ανιχνεύτηκε στα πηγάδια καλλιέργειας χρησιμοποιώντας την Μέθοδο Μεταφοράς 1 (μικρο-κωνικές ακίδες πάνω από τα κύτταρα) μέσα σε 20 λεπτά επώασης.
Συνοψίζοντας, σε αυτή την εργασία παρουσιάσαμε αρχικά μία καινοτόμο μέθοδο για την κατασκευή κάθετα ευθυγραμμισμένων συστοιχιών νανοσυρμάτων πυριτίου με κωνικό προφίλ χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό λιθογραφίας νανοσφαιρών και βαθιάς εγχράραξης με την χρήση ενεργών ιόντων. Σε δεύτερο στάδιο, χρησιμοποιήσαμε αυτές τις συστοιχίες νανοσυρμάτων πυριτίου σαν πλατφόρμα διαμόλυνσης (transfection) κυττάρων in vitro για την μεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα HEK293. Η μεταφορά του πλασμιδίου επιτυγχάνεται με μηχανική διείσδυση των νανοσυρμάτων μέσα στο κυτταρόπλασμα με την βοήθεια της φυγόκεντρου, χρησιμοποιώντας ένα πολύ σύντομο πρωτόκολλο. Προτείνουμε ότι ένα τέτοιο σύστημα μεταφοράς θα μπορούσε να είναι ένα μελλοντικό εργαλείο στην διευκόλυνση των πρακτικών της γονιδιακής θεραπείας.
|
Processing of biomaterials surfaces for gene delivery applications
