| Περίληψη |
Η επαγωγή κυτταρικού θανάτου αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο για το καθορισμό του ρόλου διαφορετικών κυτταρικών τύπων στην ανάπτυξη και αναγέννηση. Ένα χημικό-γενετικό σύστημα βασίζεται στη χρήση του βακτηριακού ενζύμου, νιτροαναγωγάσης (nitroreductase, NTR). Η νιτραναγωγάση ανάγει το υπόστρωμα Μετρονιδαζόλη (Metronidazole, Mtz) και το μετατρέπει σε κυτταροτοξικό μεταβολίτη προκαλώντας κυτταρικό θάνατο. Το σύστημα NTR/Mtz έχει εφαρμοστεί επιτυχώς στο Danio rerio και στο Mus musculus, υποδεικνύοντας το ως αποτελεσματικό εργαλείο σε διαφορετικούς οργανισμούς. Εφαρμόσαμε το NTR/Mtz σύστημα στο αμφίποδο καρκινοειδές Parhyale hawaiensis, το οποίο αποτελεί αναδυόμενο μοντέλο-οργανισμός για τη μελέτη της αναγέννησης των άκρων με πληθώρα γενετικών εργαλείων.
Διαγονίδια που έφεραν ιστοειδικούς υποκινητές ανοδικά του cfp-ntr γονιδίου, όπου η νουκλεοτιδική αλληλουχία του ενζύμου NTR έχει συζευχθεί με τη νουκλεοτιδική αλληλουχία της κυανής φθορίζουσας πρωτεΐνης (Cyan fluorescent protein, CFP), εντέθηκαν στο γονιδίωμα του Parhyale με τη χρήση του Minos μεταθετού στοιχείου, με αποτέλεσμα την έκφραση της συζευγμένης πρωτεΐνης σε κύτταρα συγκεκριμένου κυτταρικού τύπου. Η παρουσία της φθορίζουσας πρωτεϊνης CFP (Cyan Fluorescent Protein) επιβεβαίωνε την έκφραση του διαγονιδίου και τη παρουσία της πρωτεΐνης στα υπό-μελέτη κύτταρα. Επιπλέον, τα μωσαϊκά ζώα που έφεραν τα διαγονίδια παρουσίαζαν φυσιολογική ανάπτυξη. Προσθέτοντας το υπόστρωμα της νιτροαναγωγάσης, Mtz, προκαλέσαμε κυτταρικό θάνατο σε μυϊκά κύτταρα και παρατηρήσαμε τη διαδικασία μέσω των αλλαγών του κυανού φθορισμού. Με σκοπό να περιορίσουμε την έκφραση του διαγονιδίου cfp-ntr επάγοντας NTR+ κυτταρικών κλώνων στο υπο-μελέτη ιστό, ελέγξαμε δύο συστήματα ανασυνδυασμού (Cre/loxN και Flp/FRT) στο Parhyale. Το σύστημα ανασυνδυασμού FRT/Flp επιλέγηκε και ακολούθησαν πειράματα μοριακής βιολογίας για τη κατασκευή πλασμιδιακών κατασκευών με απώτερο σκοπό τη δημιουργία διαγονιδιακών σειρών. Εφαρμόζοντας το σύστημα κυτταρικού θανάτου σε NTR+ κυτταρικούς πληθυσμούς και με τη χρήση μικροσκοπίας φθορισμού (time-lapse imaging), θα μελετήσουμε την διαδικασία της αναγέννησης των άκρων μετά από θανάτωση του εκάστοτε κυτταρικού τύπου με στόχο το προσδιορισμό του ρόλου διαφορετικών κυτταρικών τύπων στην αναγέννηση.
|
Targeted cell ablation towards the identification of cell populations that participate in regeneration
