| Περίληψη |
Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια απαραίτητα για την βιωσιμότητα των περισσότερων ευκαρυωτικών κυττάρων και η βιογένεσή τους στηρίζεται στα μονοπάτια εισόδου πρωτεϊνών σε αυτά. Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) είναι ένα ένζυμο με κεντρικό ρόλο στον κυτταρικό μεταβολισμό και έχει βρεθεί σε όλους σχεδόν τους ζώντες οργανισμούς. Στα θηλαστικά η GDH αποτελεί σε ορισμένες περιπτώσεις περισσότερο από το 10% των πρωτεϊνών της μιτοχονδριακής μήτρας. Στον άνθρωπο και τα ανώτερα πρωτεύοντα εμφανίζεται με δύο ισομορφές, την hGDHI και την hGDH2, οι οποίες έχουν ένα ασυνήθιστα μεγάλο σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης (MTS) αποτελούμενο από 53 αμινοξέα (Ν53). Το Ν53 έχει την τάση σχηματισμού δύο αμφιπαθών α-ελίκων (α1, α2). Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε σκοπό τον χαρακτηρισμό του πεπτιδίου Ν53 των hGDHs και την μελέτη της εξέλιξης του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών.
Στο πρώτο τμήμα της διατριβής, βρήκαμε ότι οι in vitro συντιθέμενες hGDHs μπορούν να εισέλθουν, να κοπούν και να σχηματίσουν εξαμερή σε απομονωμένα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα. Η είσοδος των hGDHs στα μιτοχόνδρια εξαρτάται από το κανάλι TIM23, το ηλεκτροχημικό δυναμικό της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και τη συγκέντρωση των δισθενών μεταλλικών ιόντων. Παρόλο που τα τμήματα N53 των hGDHI και hGDH2 έχουν 83% ομολογία, βρέθηκε ότι η ισομορφή hGDH2 μπαίνει ή/και αποκόπτεται ταχύτερα στα μιτοχόνδρια από ότι η hGDHI. Με το ερώτημα αν υπάρχουν διαφοροποιήσεις στην μιτοχονδριακή στόχευση στον άνθρωπο λόγω της μεταλλαγής G35R στην hGDH2 που προκύπτει από τον συχνό στον πληθυσμό πολυμορφισμό του γονιδίου GLUD2 C.G103A (Plaitakis et al, 2010), μελετήσαμε την επίδρασή της μεταλλαγής αυτής σε μιτοχόνδρια και είδαμε ότι δεν επηρεάζει την είσοδό της hGDH2 στα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα. Επίσης, με σκοπό να φτιάξουμε μία κατασκευή που να μπορεί χρησιμοποιηθεί για την εύρεση μοριακών συνοδών της hGDH1, βρήκαμε ότι η εισαγωγή του επιτόπου His στο καρβοξυτελικό άκρο της hGDHI (hGDH1-His), δεν επηρεάζει την ικανότητά της να στοχεύεται στα μιτοχόνδρια και να δημιουργεί εξαμερή.
Μελετήσαμε το πεπτίδιο Ν53 κατά τμήματα και επίσης ξεχωριστά από την υπόλοιπη hGDH, ώστε να κατανοήσουμε της ιδιότητές του. Πειράματα εισόδου σε απομονωμένα μιτοχόνδρια έδειξαν ότι το πεπτίδιο Ν53 είναι απαραίτητο για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs και είναι ικανό από μόνο του να οδηγήσει την μη μιτοχονδριακή πρωτεΐνη DHFR στα μιτοχόνδρια. Επίσης, βρέθηκε ότι όταν απουσιάζει η α1 έλικα της hGDH2, η
hGDH2 χάνει την ικανότητα της για μιτοχονδριακή στόχευση. Παρατηρήθηκε ότι η αϊ της hGDH2 όταν συζευχθεί στο Ν-τελικό άκρο (αϊ-DHFR), αλλά όχι με στο C-τελικό του DHFR (DHFR-α1), μπορεί να οδηγήσει το πεπτίδιο DHFR στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, η α2 δεν βρέθηκε να έχει αυτόνομη ικανότητα μιτοχονδριακής στόχευσης. Παρατηρήθηκε ότι το συζευγμένο πεπτίδιο α1α2, αλλά όχι το πεπτίδιο α1 από μόνο του, είναι ικανό να οδηγήσει στα μιτοχόνδρια την ώριμη hGDH2. Τα ευρήματά μας είναι σε συμφωνία με πειράματα που έγιναν από τους συνεργάτες μας του Εργαστηρίου Νευρολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών με τον επίτοπο EGFP. Ως εκ τούτου, βρέθηκε ότι η μιτοχονδριακή στόχευση της hGDH2 στηρίζεται στη συνεργατική δράση των δύο α-ελίκων και ότι η α1 έχει πρωταγωνιστικό ρόλο.
Γενικά, θεωρείται ότι τα MTS δεν έχουν κάποιο συγκεκριμένο αμινοξικό μοτίβο, αλλά είναι πλούσια σε θετικά φορτισμένα αμινοξέα, χαρακτηρίζονται από αμφιπαθικότητα και τάση για δημιουργία α-έλικας. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ηλεκτρικό φορτίο στο Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου Ν53 της hGDH2 είναι πιο σημαντικό για την μιτοχονδριακή στόχευση της από ότι η αμφιπαθικότητα, η ελικοειδής διαμόρφωση και το φορτίο στο C-τελικό άκρο του. Επίσης, βρέθηκε ότι η πρωτεολυτική αποκοπή του Ν53 δεν είναι απαραίτητη για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs.
Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής, μελετήθηκε η εξέλιξη του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών χρησιμοποιώντας in silico προγράμματα πρόβλεψης για ~170 διαφορετικές πρωτεϊνικές αλληλουχίες GDH. Προβλέφθηκε ότι η εμφάνιση ύπαρξης αποκοπτόμενου MTS πιθανώς να ξεκίνησε από τα βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα και να εξελίχθηκε σταδιακά σε ένα πολύ ισχυρό, μεγαλύτερο, περισσότερο θετικά φορτισμένο και πολυπλοκότερο σινιάλο MTS στα θηλαστικά, με πιθανή εξαίρεση την GDH στα πτηνά και τα ερπετά. Επίσης, προβλέφθηκε ότι τα φυτά έχουν μη αποκοπτόμενο MTS στην GDH, ενώ δεν καταφέραμε να προβλέψουμε MTS στην GDH στους μύκητες. Στα θηλαστικά παρατηρήθηκε ότι τα αμινοξέα που απαρτίζουν την αϊ έλικα είναι εξελικτικά περισσότερο συντηρημένα σε σχέση με αυτά που απαρτίζουν την α2 έλικα.
Πειραματικές in vivo και in organello μελέτες σε συνεργασία με το Εργαστήριο Νευρολογίας έδειξαν ότι τα MTS της GDH των οργανισμών T. thermophila (βλεφαριδοφόρο), C. elegans (σκουλήκι), D. melanogaster (μύγα) και X. laevis (βατράχι) είναι ικανά να στοχεύσουν τις πρωτεΐνες DHFR και EGFP στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, βρέθηκε ότι το MTS της T. thermophila αδυνατεί να στοχεύσει αποδοτικά την ώριμη hGDH2 στα μιτοχόνδρια. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης στοιχειοθετούν ένα σημαντικό βήμα προς την πλήρη αποκάλυψη των μοριακών ιδιοτήτων, των λειτουργικών χαρακτηριστικών και της εξέλιξης των σινιάλων μιτοχονδριακής στόχευσης για την μιτοχονδριακή βιογένεση.
|
Μιτοχονδριακή στόχευση της ανθρώπινης γλουταμικής αφυδρογονάσης : δομή σινιάλου στόχευσης, λειτουργία και εξέλιξη
