| Περίληψη |
Ο τομέας της βιοανάλυσης, και ειδικότερα οι τομείς της πρωτεομικής και μεταβολομικής, απαιτούν σύγχρονες και δυναμικές αναλυτικές τεχνικές για τη μελέτη βιοχημικών φαινομένων και συστημάτων, για την εύρεση και παρακολούθηση κατάλληλων βιοδεικτών, καθώς και για την παρακολούθηση των επιπέδων σημαντικών βιομορίων σε βιολογικά υγρά και ιστούς, ακόμα και σε ιχνοποσότητες. Η δυναμική της φασματομετρίας μάζας στη μελέτη των συγκεκριμένων συστημάτων, παρέχοντας εξαιρετική ευαισθησία και ακρίβεια, δομικό, ποιοτικό και ποσοτικό χαρακτηρισμό, με την ελάχιστη κατανάλωση δείγματος, την καθιστά ως το πλέον ιδανικότερο βιοχημικό εργαλείο.
Ως εκ τούτου, στα πλαίσια της δεδομένης μεταπτυχιακής διατριβής, εφαρμόστηκαν φασματομετρικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό των κύριων μεταβολιτών του σεληνίου, καθώς και της γενικής πρωτεΐνης του ανθρώπινου ορού αίματος, της αλβουμίνης, η οποία περιέχει σεληνομεθειονίνη, σε βιολογικά υγρά. Και στις δύο δεδομένες ανεξάρτητες μελέτες, αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν μεθοδολογίες υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης σε σύζευξη με διαδοχική φασματομετρία μοριακών μαζών, υπό την παρακολούθηση επιλεγμένων μεταβάσεων ιόντων (HPLC-MRM).
Συγκεκριμένα, μία CX-RPLC-MRM μεθοδολογία εφαρμόστηκε για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό γνωστών μεταβολιτών του σεληνίου σε ανθρώπινο ορό αίματος και
ούρα. Για την απόκτηση μίας γενικευμένης εικόνας του μεταβολικού προφίλ συγκεκριμένων ανόργανων και οργανικών ενώσεων του σεληνίου στον ανθρώπινο οργανισμό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα χορήγησης εξωγενούς σεληνίου, μέσω συμπληρωμάτων διατροφής, σε εθελοντές. Το είδος και τα επίπεδα των συγκεντρώσεων μικρών μη πρωτεϊνικών ενώσεων του σεληνίου παρακολουθούνταν με την CX-RPLC-MRM μεθοδολογία στα βιολογικά υγρά των εθελοντών.
Η ταυτοποίηση των ενώσεων του σεληνίου πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή πολλαπλών ποιοτικών κριτηρίων για την αξιόπιστη ταυτοποίησή τους, ενώ για την ποσοτικοποίησή τους στα βιολογικά δείγματα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της προσθήκης γνωστής ποσότητας πρότυπων ενώσεων. Στην περίπτωση του κύριου μεταβολίτη του σεληνίου, του σεληνοσακχάρου μέθυλο-2-ακετάμιδο-2-δεόξυ-1-Se-β-D-γαλακτοζαμίνη (SeGalNAc)
χρησιμοποιήθηκε ισοτοπικά ιχνηθετημένο εσωτερικό πρότυπο για τον ακριβέστερο ποσοτικό προσδιορισμό του, δεδομένης της πολυπλοκότητας της μήτρας. Τα αποτελέσματα που λήφθηκαν επιβεβαιώθηκαν με φασματομετρία ατομικών μαζών (HPLC-ICP/MS) από εξωτερικούς συνεργάτες (κ. Καθηγητής K.A. Francesconi, Πανεπιστήμιο Γκρατς, Αυστρία).
Η παρακολούθηση των επιπέδων του σεληνίου στον ανθρώπινο οργανισμό καθίσταται αναγκαία, καθώς ο διαχωρισμός μεταξύ της ευεργετικής και της τοξικής δράσης του στοιχείου αυτού στον άνθρωπο είναι αρκετά στενός. Επιπλέον, ο μεταβολισμός του
σεληνίου δεν έχει, ακόμα, αποσαφηνιστεί πλήρως, και επομένως, τα δεδομένα που λαμβάνονται από μελέτες όπως η συγκεκριμένη της παρούσας διατριβής, συνεισφέρουν στην κατανόηση αυτού. Ειδικότερα, μέσω της δεδομένης εργασίας, μελετήθηκαν για πρώτη φορά τα μεταβολικά προϊόντα της μέθυλο-σεληνοκυστεΐνης στον ανθρώπινο οργανισμό κατόπιν λήψης του αντίστοιχου συμπληρώματος διατροφής.
Ο ορός αίματος αποτελεί το καταλληλότερο μέσο για την παρακολούθηση των επιπέδων του σεληνίου στον οργανισμό, καθώς αντανακλά άμεσα τις αλλαγές της κατάστασης του ιχνοστοιχείου που σχετίζονται με τη διατροφική του πρόσληψη αλλά και με διαταραχές στην υγεία. Όμως, η χαμηλή αφθονία των μικρών ενώσεων του σεληνίου στον ορό αίματος αλλά και η πολυπλοκότητα της μήτρας αυτού, αποτελούν πρόκληση από την αναλυτική σκοπιά. Η CX-RPLC-MRM μεθοδολογία που αναπτύχθηκε, ανταπεξήλθε στην ποσοτικοποίηση του κυρίαρχου μεταβολίτη του σεληνίου, του σεληνοσακχάρου SeGalNAc,
στον ορό αίματος, αποτελώντας την πρώτη μέθοδο φασματομετρίας μοριακών μαζών που χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για ενώσεις του σεληνίου σε ορό αίματος.
Επίσης, αναπτύχθηκε μία bottom-up RPLC-MRM μεθοδολογία για την ταυτοποίηση και τη label-free ποσοτικοποίηση της αλβουμίνης του ανθρώπινου ορού αίματος, με επίτευξη
ικανοποιητικά χαμηλών ορίων ανίχνευσης, μέσω παρακολούθησης χαρακτηριστικών πεπτιδίων της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Η αλβουμίνη του ορού αίματος (HSA) αποτελεί μία υψηλής αφθονίας πρωτεΐνη, αντιπροσωπεύοντας το 60 % του συνόλου των πρωτεϊνών
στο αίμα, και θεωρείται βιοδείκτης διαφόρων παθήσεων, όπως η οξεία νεφρική βλάβη. Όμως, παρουσιάζει σημαντική μικροετερογένεια, κυρίως μέσω της γλυκοζυλίωσης και της οξείδωσής της, με τα φαινόμενα αυτά να ενισχύονται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως σε ασθενείς με διαβήτη.
Η αδυναμία των εφαρμοζόμενων τεχνικών που χρησιμοποιούνται σε αναλύσεις ρουτίνας για τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό της αλβουμίνης, όταν αυτή εμφανίζει αυξημένη μικροετερογένεια, αποτέλεσαν το κίνητρο της δεδομένης μελέτης, κατά την οποία πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες για την ανάπτυξη μίας bottom-up RPLC-MRM μεθοδολογίας με υψηλή ανεκτικότητα στη βιολογική μεταβλητότητα.
Τέλος, η αλβουμίνη ενσωματώνει στην πολυπεπτιδική της αλυσίδα σεληνομεθειονίνη, μέσω της τυχαίας και μη ελεγχόμενης αντικατάστασης ορισμένων καταλοίπων μεθειονίνης
της πρωτεΐνης από σεληνομεθειονίνη. Στα πλαίσια μίας προσπάθειας για την ανίχνευση του σεληνίου σε επίπεδο πεπτιδίων, εγγενής ορός αίματος αναλύθηκε μέσω nRPLC-SIM
παρακολούθησης των πεπτιδίων της αλβουμίνης που περιέχουν μεθειονίνη και των αντίστοιχων δυνητικών αναλόγων τους με σεληνομεθειονίνη. Σκοπός ήταν η συσχέτιση της αφθονίας των πεπτιδίων που περιέχουν μεθειονίνη και σεληνομεθειονίνη, για την πιθανή εύρεση κάποιου μηχανισμού της βιοχημικής κατανομής του σεληνίου στην αλβουμίνη.
|
Ανάπτυξη μεθόδων φασματομετρίας μάζας για τον προσδιορισμό πρωτεινών και μεταβολιτών σεληνίου
