| Περίληψη |
Οι οξειδάσες των πολυαμινών (PAOs) είναι ένζυμα που καταλύουν την οξειδωτική απαμίνωση των ανώτερων πολυαμινών (PAs), παράγοντας Η2Ο2 και αλδεΰδες. Το Η2Ο2 έχει σηματοδοτικό ρόλο, επάγοντας είτε αμυντικές αποκρίσεις ή την καταστροφή του κυττάρου. Προκειμένου να διευκρινιστεί ο σηματοδοτικός και ο φυσιολογικός ρόλος τoυ παραγόμενου Η2Ο2, που παράγεται από το αποπλασματικό ένζυμο PAO, κατασκευάστηκαν γενετικά τροποποιημένα φυτά (ΓΤΦ) καπνού, που υπερεκφράζουν (S-pao) και υποεκφράζουν (A-pao) το γονίδιο pao από τον αραβόσιτο. Tα ΓΤΦ φυτά παρουσιάζουν μειωμένα και αυξημένα επίπεδα, αντίστοιχα, των ανώτερων PAs σπερμιδίνη (Spd) και σπερμίνη (Spm). Παρ’ όλα αυτά δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα του Η2Ο2 σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου (WT) σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. Το γεγονός αυτό οφείλεται σε επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων, που επιτελούν την αντιοξειδωτική άμυνα των κυττάρων, ώστε να αποσβεστεί το επί πλέον Η2Ο2, που παράγεται από την οξείδωση των PAs. Αντίθετα, υπό την επίδραση παραγόντων καταπόνησης, που επάγουν την παραγωγή του Η2Ο2, ο προ-επαγμένος αντιοξειδωτικός μηχανισμός στα ΓΤΦ S-paoδεν ήταν σε θέση να αποσβέσει το επί πλέον Η2Ο2, με αποτέλεσμα την επαγωγή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (programmed cell death, PCD). ΄Ετσι, σε συνθήκες υψηλής αλατότητας τα S-pao φυτά ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα σε σχέση με το αντίστοιχα φυτά WT, ενώ αντίθετα τα A-pao φυτά, ήταν πιο ανθεκτικά. Ακόμη, διαλευκάνθηκε ο μηχανισμός δράσης των PAs κατά την καταπόνηση. ΄Ετσι βρέθηκε ότι επάγεται η βιοσύνθεση των PAs σε συνθήκες υψηλής αλατότητας και η Spd μεταφέρεται στον αποπλάστη, όπου οξειδώνεται από την PAO. Τα S-pao, κατά συνέπεια, οξειδώνουν γρηγορότερα την μεταφερόμενη στον αποπλάστη Spd και παράγουν μεγαλύτερες ποσότητες Η2Ο2, σε αντίθεση με τα A-pao. Η παραγωγή Η2Ο2 έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή έκφρασης αμυντικών γονιδίων, των οποίων η επαγωγή εξαρτάται από τα επίπεδα του παραγόμενου Η2Ο2. Κατά συνέπεια, η υψηλή ποσότητα Η2Ο2 δεν επάγει τα αντίστοιχα γονίδια, των οποίων η επαγωγή απαιτεί μέτρια επίπεδα Η2Ο2 με αποτέλεσμα την επαγωγή του PCD στα S-pao φυτά. Συγχρόνως, οι ενδογενείς PAs παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναστολή του PCD, καθώς ΓΤΦ φυτά, που κατασκευάστηκαν και υποεκφράζουν το γονίδιο samdc που εμπλέκεται στη παραγωγή των ανώτερων PAs, ενώ παρουσιάζουν φυσιολογική οξείδωση στον αποπλάστη των PAs, ενεργοποιούν τον PCD, όπως και στην περίπτωση των S-pao φυτών. Αντίθετα, σε βιοτικές καταπονήσεις, τα ΓΤΦ S-pao παρουσιάζουν αυξημένη ανθεκτικότητα απέναντι στα βακτήρια, στους ωομύκητες αλλά όχι στους ιούς. Η αυξημένη ανθεκτικότητα των φυτών αυτών οφείλεται σε δύο παράγοντες. Στην επαγωγή των γονιδίων άμυνας εναντίων των παθογόνων και σε τροποποιήσεις του κυτταρικού τοιχώματος, που εξαρτώνται από το Η2Ο2, ώστε να είναι τα φυτά λιγότερο ευπρόσβλητα, ενώ φαίνεται ότι το Η2Ο2 είναι απευθείας τοξικό για τα βακτήρια και τους ωομύκηκτες. Η παραγωγή του Η2Ο2 εξαρτάται, στην περίπτωση της βιοτικής καταπόνησης, από την έξοδο στον αποπλάστη της Spm και όχι της Spd, όπως συμβαίνει κατά την αβιοτική καταπόνηση. Αντίθετα, τα A-pao δεν παρουσιάζουν ανάλογη αντίδραση και φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητα σε καταπονήσεις από βακτήρια. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε κλωνοποιήση των γονιδίων που περιέχουν συναινετικές αλληλουχίες για τη κωδικοποιήση PAO ενζύμων από το φυτό Arabidopsis. Βρέθηκαν πέντε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με δομικά αυτοτελείς περιοχές, που απαντώνται στα ένζυμα με ενεργότητα PAO. Τα γονίδια εκφράστηκαν σε ετερόλογα συστήματα και απομονώθηκαν οι πρωτείνες. Δείχθηκε ότι τέσσερις από τις πέντε (AtPAO1, AtPAO2, AtPAO3, AtPAO4 και AtPAO5) οξειδώνουν τις PAs και συγκεκριμένα τη Spd και τη Spm. Σε αντίθεση με τις αποπλασματικές οξειδάσες, τα γονίδια αυτά εμπλέκονται στην αλληλομετατροπή των PAs, παράγοντας Put από Spm με ενδιάμεσο μόριο τη Spd και παράλληλα Η2Ο2, ενώ οι αντίστοιχες πρωτεΐνες δεν εντοπίζονται στον αποπλάστη. Γονίδια με τέτοια λειτουργικότητα, είχαν χαρακτηριστεί στα ζωϊκά κύτταρα ενώ η παρουσία τους δεν είχε αναφερθεί στα φυτικά. Προκειμένου να διευκρινιστεί ο φυσιολογικός ρόλος των γονιδίων αυτών κατασκευάστηκαν ΓΤΦ που υπερεκφράζουν τρία από αυτά τα γονίδια (AtPAO1, AtPAO3 και AtPAO5). Τα ΓΤΦ που υπερεκφάζουν το γονίδιο AtPAO3 παρουσιάσαν σημαντικά αυξημένα ενδογενή επίπεδα Put, χωρίς ταυτόχρονη μείωση των επιπέδων Spd ή Spm καθώς σε αυτά τα φυτά δρα ένας αναδραστικός μηχανισμός με τον οποίο αναπληρώνονται τα επίπεδα της Spd, που χρησιμοποιούνται για τη παραγωγή Put. Ειδικότερα, τα επίπεδα της αποκαρβοξυλάσης της αργινίνης (ADC) και της Spd συνθάσης (SPDS) βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα. Τα ΓΤΦ αυτά παρουσίασαν επίσης αυξημένη ανθεκτικότητα απέναντι στην ωσμωτική καταπόνηση, πιθανότατα εξ αιτίας των αυξημένων επιπέδων της 3-αμινοπροπανάλης, που παράγονται σε αυτά, η οποία μπορεί να οδηγείται στη παραγωγή της β-αλανίνης μπεταΐνης που είναι συμβατός ωσμωλύτης και συνεισφέρει στην ανθεκτικότητα εναντίων της ωσμωτικής καταπόνησης. Συνολικά, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην διατριβή αυτή δείχνουν ότι η αποπλασματική οξείδωση των PAs προκαλεί ευαισθησία στις αβιοτικές καταπονήσεις και ανθεκτικότητα στις βιοτικές. Η μη αποπλασματική οξείδωση των PAs φαίνεται να έχει ένα πιο περίπλοκο ρόλο, καθώς εμπλέκεται, μεταξύ άλλων, και στην αυστηρή ρύθμιση των επιπέδων των PAs, εφόσον αποτελούν ένα επί πλέον μονοπάτι ελέγχου των ενδογενών συγκεντρώσεων κάθε PA ξεχωριστά.
|
Ανάλυση του φυσιολογικού ρόλου των οξειδασών των πολυαμινών σε άγριου τύπου και γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού (Nicotiana tabacum L.) & arabidopsis (Arabidopsis thaliana)
