| Περίληψη |
Ο φωτοσυνθετικός μηχανισμός στα ανώτερα φυτά και τα χλωροφύκη αποτελείται από τέσσερα μεγαλομοριακά σύμπλοκα, που εδράζονται ανυσματικά στις θυλακοειδείς μεμβράνες του χλωροπλάστη και κατηγοριοποιούνται σε δύο είδη φωτοσυστημάτων (I και II), ένα κυτόχρωμα (Cytb6f) και μία συνθάση ΑΤΡ. Τα τρία πρώτα είναι υπεύθυνα για τη ροή των ηλεκτρονίων και την φόρτιση της μεμβράνης των θυλακοειδών από πρωτόνια, που απελευθερώνονται προς την πλευρά του μικροχώρου. Η τελευταία (ΑΤΡάση) είναι υπεύθυνη για την αποφόρτιση της μεμβράνης και την παραγωγή ενέργειας υπο μορφή ΑΤΡ. Τα σύμπλοκα λειτουργούν συγχρόνως και η ροή των ηλεκτρονίων είναι συζευγμένη με την σύνθεση ΑΤΡ. Η λειτουργικότητα του μηχανισμού κάτω από τις διαρκώς μεταβαλλόμενες συνθήκες (π.χ. θερμοκρασίας, έντασης φωτός, διαθεσιμότητας θρεπτικών), εξασφαλίζεται με πολύπλοκους μηχανισμούς αυτορρύθμισης. Η ταχύτατη ενεργοποίηση (ακόμη και εντός δευτερολέπτων) αυτών των εξειδικευμένων δικλείδων ασφαλείας και η ελεγχόμενη ενεργοποίηση, μόνο όταν το απαιτούν οι συνθήκες, εξασφαλίζει υψηλότατες αποδόσεις σε χαμηλό φωτισμό και από την άλλη υψηλή φωτοπροστασία σε έντονο φωτισμό. Η παρούσα εργασία αφιερώθηκε στη μελέτη του ρόλου των πολυαμινών (πουτρεσίνη: Put, σπερμιδίνη: Spd και σπερμίνη: Spm) κατά την ανάπτυξη και τη λειτουργική οργάνωση του φωτοσυνθετικού μηχανισμού. Οι πολυαμίνες είναι χαμηλού μοριακού βάρους αμίνες με 2, 3, και 4 αμινομάδες, αντίστοιχα, που απαντώνται σε όλα τα κύτταρα (προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά). Θεωρούνται αυξητικοί παράγοντες χωρίς όμως να έχει βρεθεί ο μοριακός μηχανισμός δράσης τους. Επίσης, συνδέονται με την αντοχή των κυττάρων σε καταπονήσεις και συνήθως ανικανότητα αύξησης των πολυαμινών σε συνθήκες καταπόνησης αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων/οργανισμών. Στο χλωροπλάστη είναι παρούσες σε φυσιολογικές συνθήκες και σταθεροποιούνται σε νέα επίπεδα μετά από μία σημαντική μείωση κατά τη διαφοροποίηση του πλαστιδίου, αλλά η γνώση για τον τρόπο με το οποίο δρουν είναι αποσπασματική. Στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε να αποσαφηνισθεί ο ρόλος τους στο φωτοσυνθετικό μηχανισμό. Τα πειραματικά αποτελέσματα είναι χωρισμένα σε 4 θεματικές ενότητες (4 Κεφάλαια). Στο 1ο κεφάλαιο, η συγκριτική μελέτη της φωτοανεξάρτητης και της φωτοεξαρτώμενης βιογένεσης του φωτοσυνθετικού μηχανισμού αποκάλυψε ότι ο λόγος που οι πολυαμίνες μειώνονται φυσιολογικά κατά τη βιογένεση είναι διότι πρέπει να επιτρέψουν τη βιοσύνθεση της χλωροφύλλης και την συνεπακόλουθη δημιουργία των φωτοσυστημάτων. Αν διατηρηθούν σε υψηλά επίπεδα (>2mM Spm) αναστέλλουν την αναγωγή του πρωτοχλωροφυλλιδίου, εμποδίζουν τη σύνθεση της χλωροφύλλης και ως εκ τούτου εμποδίζουν τη δημιουργία του φωτοσυνθετικού μηχανισμού. Η αναπτυξιακή μελέτη και η χρήση ειδικών μεταλλαγμάτων (C-2A΄ και Wt-LHC) υπέδειξε την διαχείριση της συλλεγόμενης φωτονιακής ενέργειας ως τη γενικότερη διαδικασία στην οποία συμμετέχουν οι πολυαμίνες. Επίσης, παρουσιάζεται για πρώτη φορά η φάση λειτουργικής ενεργοποίησης στη φωτοανεξάρτητη βιογένεση του χλωροπλάστη (διάκριση φωτοσυνθετικού μηχανισμού intact-inactive από μηχανισμό intact-active). Πρόκειται για μία ταχύτατη φάση λειτουργικής οργάνωσης, κατά την οποία η φωτοσυλλεκτική κεραία του PSII οργανώνεται (αύξηση βαθμού ολιγομερισμού από 10% σε 90%), η σπερμίνη που βρίσκεται προσδεμένη στην κεραία αυξάνει κατά 50% και η φωτοσυνθετική απόδοση μεγιστοποιείται (αύξηση από 0.31 σε άνω του 0.70). Η φάση μπορεί να διαρκέσει 300 s όταν οι συνθήκες φωτισμού είναι κατάλληλες (1000 μmol quanta.m-2s-1). Η διεξοδική μελέτη (κεφαλαιο 2) της ρύθμισης της φωτοσυνθετικής διαδικασίας έδειξε διακριτούς ρόλους για την πουτρεσίνη σε σχέση με τις άλλες δύο πολυαμίνες, οι οποίοι επιβεβαιώθηκαν από in vitro μελέτες. Η χορήγηση πουτρεσίνης αναστελλει την πρώιμη ενεργοποίηση του ΝPQ (μηχανισμού ελεγχόμενης μη φωτοχημικής διάχυσης της περίσσειας ενέργειας), ενδεικτικό μη ενεργοποίησης του PsbS και καθυστερεί το ρυθμό αποφόρτισης της μεμβράνης των θυλακοειδών. Επίσης, φάνηκε ότι η Spd και Spm είναι σε θέση να ρυθμίζουν το ποσό της συλλεγμένης φωτονιακής ενέργειας που θα διαχυθεί ελεγχόμενα σε μορφή θερμότητας και ότι μπορούν να ενεργοποιήσουν τους μηχανισμούς φωτοπροστασίας ακόμη και στο σκοτάδι. Στο κεφάλαιο 3, η ικανότητά τους αυτή αποδείχθηκε -μετά από διαδοχικές βιοχημικές απομονώσεις θυλακοειδών μεμβρανών και τελικά της φωτοσυλλεκτικής κεραίας του φωτοσυστήματος ΙΙ- ότι σχετίζεται με μια αλληλεπίδραση απευθείας με τη φωτοσυλλεκτική κεραία. Η μελέτη του μηχανισμού της αλληλεπίδρασης υπέδειξε την ιμινοομάδα των πολυαμινών ως υπεύθυνη ομάδα για την απόσβεση. Επιπλέον, φάνηκε ότι ο μηχανισμός της αλληλεπίδρασης στηρίζεται σε μια pH εξαρτώμενη απόσβεση του φθορισμού της χλωροφύλλης. Τα χαρακτηριστικά του μηχανισμού (ενεργοποίηση από πρωτονίωση, άμεση αλληλεπίδραση πολυαμινών και πολυπεπτιδίων της φωτοσυλλεκτικής κεραίας) υπερτερούν, σε σύγκριση με το ευρύτερα αποδεκτό μοντέλο μη φωτοχημικής διαχείρισης, που εμπλέκει το κύκλο των ξανθοφυλλών, χωρίς όμως να το απορρίπτουν. Πιο συγκεκριμένα, το μοντέλο που δέχεται ότι αποσβέστης της χλωροφύλλης είναι η ζεαξανθίνη εξαρταται επίσης από τα δύο παραπάνω χαρακτηριστικά (πρωτονίωση/οξίνιση μικροχώρου και φωτοσυλλεκτική κεραία) όμως απαιτεί δύο επιπρόσθετα βήματα από τα οποία το ένα είναι ενζυμικό, που καθιστά το μηχανισμό πιο αργό, σε σύγκριση με αυτόν, που προτείνει η παρούσα εργασία. Συνεπώς οι πολυαμίνες φαίνεται ότι εμπλέκονται σε μια πρώτη απόκριση στην περίσσεια φωτονιακής ενέργειας και στη συνέχεια ενδέχεται σε ένα δεύτερο στάδιο να παίρνουν μέρος τα καροτενοειδή, που είναι ήδη γνωστό ότι ενισχύουν τη διάχυση. Σε συμφωνία με τα παραπάνω δείχθηκε ότι σε κατάλληλα μεταλλάγματα χλωροφυκών που δεν διαθέτουν φωτοσυλλεκτική κεραία οι πολυαμίνες δεν μπορούν να συμμετάσχουν στη διαχείριση της συλλεγμένης φωτονιακής ενέργειας. Επιπρόσθετα, φάνηκε ένας ενεργοποιητικός ρόλος της Spm στα κέντρα αντίδρασης του φωτοσυστήματος ΙΙ. Στο 4ο κεφάλαιο επιβεβαιώθηκε το τελευταίο και σε απομονωμένους χλωροπλάστες και φασματοσκοπία χαμηλών θερμοκρασιών (77Κ) έδειξε ότι πιθανότατα η δράση της Spm συνδέεται με την συναρμολόγηση των κέντρων αντίδρασης με την εσωτερική κεραία του φωτοσυστήματος ΙΙ. Τέλος, από πειράματα σε απομονωμένους χλωροπλάστες αναδείχθηκαν οι κατιονικές και μη κατιονικές δράσεις των πολυαμινών στο φωτοσυνθετικό μηχανισμό. Οι πολυαμίνες αποδείχθηκαν περισσότερο ικανές, από ανόργανα ιόντα που φυσιολογικά υπάρχουν σε χλωροπλάστες, να διατηρούν τη λειτουργικότητα ή να αυξάνουν την απόδοση του φωτοσυνθετικού μηχανισμού (αυξήσεις έως 70%). Η ποσοτικοποίηση των κατιοντικών επιδράσεων της πουτρεσίνης, της Spd και της Spm στη γραμμική ροή ηλεκτρονίων, στην ενεργότητα του PSII και στη μέγιστη φωτοσυνθετική απόδοση επέτρεψε στη συνέχεια τη μελέτη μη-κατιοντικών δράσεων. Οι τελευταίες αναδείχθηκαν μέσα από τη μελέτη της διαδικασίας της φωτοφωσφορυλίωσης. Οι πολυαμίνες φάνηκε (σε συνθήκες που προσομοιώνουν τις αντίστοιχες in vivo) πως έχουν την ικανότητα να αυξάνουν τη σύνθεση ΑΤΡ έως και 80% (περίπτωση Put). Ακόμη αποδείχθηκε ότι, για την ίδια παρεχόμενη φωτονιακή ενέργεια, ο φωτοσυνθετικός μηχανισμός λειτουργώντας παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων πουτρεσίνης μπορεί να αυξήσει ή να μειώσει τη σύνθεση ενέργειας. Η ικανοτήτα των πολυαμινών και περισσότερο της Put να αυξάνει τη σύνθεση ΑΤΡ προτείνεται ως μια κεντρική δράση που ερμηνεύει γιατί οι πολυαμίνες δρουν ως παράγοντες αύξησης των κυττάρων αλλά και αυξάνονται σε συνθήκες καταπόνησης (διαδικασίες με υψηλό ενεργειακό κόστος). Επίσης, η συνεκτίμηση του ρυθμού χαλάρωσης της φόρτισης της μεμβράνης των θυλακοειδών σε περιπτώσεις υψηλής ενδοκυτταρικής πουτρεσίνης, καθώς και τα βιοχημικά χαρακτηριστικά της Put, της μεμβράνης των θυλακοειδών και των συνθηκών pH σε μικροχώρο και στρώμα οδήγησαν στην πρόταση ενός μοντέλου για το μηχανισμό δράσης της Put. Το μοντέλο αυτό εξηγεί ικανοποιητικά τα in vivo αποτελέσματα αυτής της εργασίας και επίσης αποτελεί τη βάση για μια νέα βιοενεργητική προσέγγιση του ρόλου των πολυαμινών στο φωτοσυνθετικό μηχανισμό.
|
Συγκριτική μελέτη του ρόλου των πολυαμινών στη φωτοανεξάρτητη και φωτοεξαρτώμενη ανάπτυξη και λειτουργική οργάνωση του φωτοσυνθετικού μηχανισμού
