Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Φυσική χαρτογράφηση υψηλής ευκρίνειας στη χρωμοσωμική περιοχή 10q23 του ανθρώπου και συμβολή στη λειτουργική ανάλυση του γονιδίου Neuralized  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου uch.biology.phd//2005kokkinaki
Τίτλος Φυσική χαρτογράφηση υψηλής ευκρίνειας στη χρωμοσωμική περιοχή 10q23 του ανθρώπου και συμβολή στη λειτουργική ανάλυση του γονιδίου Neuralized
Άλλος τίτλος High resolution physical mapping of human chromosomal region 10q23 and contribution to the fuctional analysis of Neuralized gene
Συγγραφέας Κοκκινάκη, Μαρία
Σύμβουλος διατριβής Μοσχονάς, Ν.Κ/
Περίληψη H παρούσα διατριβή αποτελείται από δύο μέρη. Στο πρώτο, περιγράφουμε την κατασκευή ενός υψηλής ευκρίνειας φυσικού χάρτη με στόχο την αλληλούχηση της πλούσιας σε γονίδια περιοχής q23.31-q23.33 του χρωμοσώματος 10 του ανθρώπου και αξιοποιούμε την πληροφορία που προκύπτει από την in silico ανάλυση της αντίστοιχης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Στο δεύτερο, παρουσιάζουμε τη μελέτη δομικών, εξελικτικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του γονιδίου Νeuralized (Neurl) του ποντικού, ορθόλογου του ανθρώπινου ΝΕURL, που χαρτογραφείται πλησίον της παραπάνω χρωμοσωμικής περιοχής. Χρησιμοποιώντας ως ανιχνευτές 36 STSs (Sequence Tag Sites), που χαρτογραφούνται στην περιοχή 10q23.31-q23.33, απομονώσαμε 22 και 316 χρωμοσωμικούς κλώνους PAC και BAC, αντίστοιχα. Ο δομικός χαρακτηρισμός των κλώνων έγινε με σύγκριση του προτύπου τεμαχισμού τους με διάφορα περιοριστικά ένζυμα και έτσι δημιουργήθηκε ένα ενιαίο, ιδιαίτερα αξιόπιστο contig κλώνων μήκους 4.38 Mb, που ορίζεται από τους μικροδορυφορικούς γενετικούς δείκτες D10S451 και D10S583, που τοποθετούνται εγγύς και άπω του κεντρομερούς, αντίστοιχα. Με βάση αυτό το contig, επιλέχθηκαν από το συνεργαζόμενο εργαστήριο του Sanger Center 35 κλώνοι BAC, οι οποίοι διατρέχουν τη συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή και έχουν τη μικρότερη δυνατή επικάλυψη. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία που προέκυψε από την ανάλυση αυτών των κλώνων είναι ενιαία καθ’ όλο το μήκος του contig. Όπως προσδιορίστηκε μετά από συστηματική ανάλυση in silico, η περιοχή που περικλείεται από τους ανωτέρω δείκτες περιέχει 51 γονίδια, 35 από τα οποία είναι άγνωστης λειτουργίας. Από τα τελευταία, 11 κωδικοποιούν πολυπεπτίδια που φέρουν χαρακτηριστικές περιοχές ομολογίας με πρωτεΐνες γνωστής λειτουργίας. Πρόσφατες αναφορές μιας σειράς ερευνητικών ομάδων, συμπεριλαμβανομένης και της δικής μας, έχουν προτείνει ότι η πρωτεΐνη neuralized της δροσόφιλας συμμετέχει στη σηματοδότηση Notch και ότι η ορθόλογη πρωτεΐνη Neurl του ποντικού πιθανόν να έχει ρυθμιστικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Με σκοπό τoν περαιτέρω χαρακτηρισμό του Neurl, απομονώσαμε 17 κλώνους βακτηριοφάγου από μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη ποντικού (στέλεχος 129SV) και προσδιορίσαμε τη χρωμοσωμική οργάνωση του γονιδίου. Με βάση τα πειραματικά μας αποτελέσματα σε συνδυασμό με πληροφορίες από διάφορες βάσεις δεδομένων, το γονίδιο εκτείνεται σε 79 Kb χρωμοσωμικής αλληλουχίας, αποτελείται από 7 εξόνια και φαίνεται ότι ελέγχεται από δύο διαφορετικούς, εναλλακτικά χρησιμοποιούμενους υποκινητές, ο ένας από τους οποίους βρίσκεται εντός του πρώτου ιντρονίου, μήκους 47.3Κb. To γονίδιο κωδικοποιεί δύο πολυπεπτίδια Neurl, μήκους 574 και 557 αμινοξέων, που διαφέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο, λόγω της χρήσης των εξονίων 1 και 1α από τους δύο εναλλακτικούς υποκινητές. Λεπτομερής συγκριτική ανάλυση στο νουκλεοτιδικό επίπεδο έδειξε ότι η χρωμοσωμική οργάνωση του γονιδίου είναι παρόμοια στα έντομα και στα θηλαστικά και επισήμανε πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία του γονιδίου των θηλαστικών. Αντίστοιχα, από τη συστηματική σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας των ορθόλογων πρωτεϊνών μιας σειράς οργανισμών (C. elegans, D. melanogaster, A. gambiae, F. rubripes, D. rerio, X. Laevis, R. norvegicus) αποκαλύφθηκε ότι η οικογένεια των πρωτεϊνών neuralized είναι αρκετά συντηρημένη στους ζωικούς οργανισμούς από τον νηματώδη και τα έντομα έως τα θηλαστικά, εμφανίζοντας υψηλότερη συντήρηση στις χαρακτηριστικές περιοχές NEUZ1, 2 και RING. Συγκεκριμένα, το NEUZ1 είναι η πιο συντηρημένη περιοχή του Neurl στα σπονδυλωτά, ενώ το RING είναι η πιο συντηρημένη περιοχή μεταξύ σπονδυλωτών και ασπόνδυλων. Το τελευταίο, πιθανόν, υποδηλώνει την καθοριστική σημασία του RING στη λειτουργία της πρωτεΐνης και τον παρόμοιo βιοχημικό ρόλο του neuralized μεταξύ των ειδών. Με στόχο την περαιτέρω διαλεύκανση του βιολογικού ρόλου του Neurl, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα δύο υβριδίων του σακχαρομύκητα για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν άμεσα με αυτό. Η διερεύνηση απέδωσε εννέα λιγότερο ή περισσότερο καλά χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες, που συμμετέχουν σε σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου, ήτοι στην ενδοκυττάρια κίνηση μέσω πρωτεϊνών - κινητήρων, στην κίνηση ή σταθερότητα του κυττάρου (Dlc-1, Gas8, Evpl και Αnkycorbin), στην κυτταρική διαίρεση ή απόπτωση (Numa1, Lek1, Dlc-1, Peg3), σε μετα- μεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών (Ubc9) και στη μεταγραφική ρύθμιση (Dnmt3a). Οι αλληλεπιδράσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με δοκιμές πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης in vitro και μετά από παροδική συνέκφραση σε κύτταρα θηλαστικών, εφαρμόζοντας τις μεθόδους GST-pull-down και συν-ανοσοκατακρήμνισης (co-IP), αντίστοιχα. Πρόσθετες ενδείξεις που υποστηρίζουν αυτές τις αλληλεπιδράσεις προέκυψαν από: i. τον προσδιορισμό των επικαλύψεων στο πρότυπο έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων, με πειράματα υβριδοποίησης RNA in situ σε τομές εμβρύων ποντικού, και ii. την ανίχνευση του υποκυτταρικού συνεντοπισμού των ενδογενών ή/και παροδικά εκφραζόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, με παρατήρηση σε συνεστιακό μικροσκόπιο. Όπως έδειξαν πειράματα co-IP, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν αλληλοσυμπληρούμενα ελλεμματικά πολυπεπτίδια Neurl, oι αλληλεπιδράσεις του με τις άλλες πρωτεΐνες επιτυγχάνονται γενικά, μέσω των περιοχών NEUZ1 και ΝΕUZ2, με ορισμένες όμως, διαφοροποιήσεις. Συγκεκριμένα, το NEUZ1 είναι απόλυτα αναγκαίο και ικανό για την αλληλεπίδραση του Neurl με τις πρωτεΐνες Dlc-1 και Gas8 αλλά όχι με την Ubc9, ενώ το RING είναι απαραίτητο για τη βέλτιστη πρόσδεση του Neurl στο Ubc9. Με βάση τα αποτελέσματά μας και σε συμφωνία με τον γενικό χαρακτηρισμό που αποδίδεται σε πρωτεΐνες που διαθέτουν περιοχή RING, προτείνουμε για το Neurl τον ρόλο του ‘μεσολαβητή’, δηλαδή ενός ενδιάμεσου μορίου που φέρνει επιλεκτικά σε επαφή διάφορες πρωτεΐνες μεταξύ τους, συμμετέχοντας με αυτόν τον τρόπο σε λειτουργικά πολυ-πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Έτσι, η αλληλεπίδρασή του με την Dlc-1 πιθανόν να εξηγεί τη αποδιοργανωμένη δομή του αξονήματος στα σπερματοζωάρια των αρσενικών ποντικών Neurl -/-. Επιπλέον, η αλληλεπίδρασή του με το Ubc9 είναι πιθανόν να υποδηλώνει είτε τη μετα-μεταφραστική τροποποίησή του Neurl με το πεπτίδιο SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier), ή τον ρόλο του ως λιγάση Ε3 σε διαδικασίες SUMOλίωσης άλλων πρωτεϊνών. Αξίζει να σημειωθεί ότι αρκετές από τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με το Neurl εμφανίζουν κατάλληλες θέσεις για SUMOλίωσης και θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως υποψήφια υποστρώματα. Πράγματι, για μία από αυτές, την Dnmt3a, έχει ήδη επιβεβαιωθεί η τροποποίησή της με SUMO. Συμπερασματικά, θεωρούμε ότι η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το Neurl, έχει θεμελιώδη σημασία για την αποσαφήνιση του βιολογικού του ρόλου και αποτελεί τη βάση για τον σχεδιασμό μιας μακράς σειράς σημαντικών in vitro και in vivo πειραμάτων για την περαιτέρω λειτουργική ανάλυση της πρωτεΐνης.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Χάρτες, Φυσικός υψηλής ευκρίνειας; Δυνείνη; Πρωτεϊνες, Κινητήρας; Αξόνημα; Σακχαρομύκητες, Σύστημα δύο υβριδίων; E3 λιγάση Sumo; E3 λιγάση ουβικουϊτίνης; Ένζυμα, Sumo Συζευκτικά
Ημερομηνία έκδοσης 2005-02-28
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 27

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 4