| Περίληψη |
Το σύστημα έκκρισης τύπου ΙΙΙ (T3SS) είναι ένα ευρέως διαδεδομένο σύστημα που χρησιμοποιείται από πολλά παθογόνα, κατά Gram αρνητικά βακτήρια. Το σύστημα τύπου ΙΙΙ, είναι μια εξειδικευμένη μικρο-μηχανή που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά των μολυσματικών παραγόντων του βακτηρίου από το κυτταρόπλασμα του κατευθείαν μέσα στο κύτταρο ξενιστή, διαπερνώντας τρεις μεμβρανικές δομές, δύο βακτηριακές και μία ευκαρυωτική. Το σύστημα έκκρισης τύπου ΙΙΙ σχηματίζει μια δομή στο χώρο που μπορεί να παρομοιαστεί με βελόνα (injectisome). Η βελονοειδής αυτή κατασκευή, διαχωρίζεται σε τρία δομικά στοιχεία: το βασικό σωμάτιο, που απαρτίζεται από κυλινδρικές κατασκευές και ενώνει την εξωτερική με την εσωτερική μεμβράνη του βακτηρίου ' το ινίδιο το οποίο εξέρχεται από το βασικό σωμάτιο και προσκολλάται στη μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή, ώστε να δημιουργηθεί ένας συνεχόμενος κενός δίαυλος από το βακτηριακό κυτταρόπλασμα στο ευκαρυωτικό. Τέλος, στη βάση του βασικού σωματίου από τη μεριά της εσωτερικής βακτηριακής μεμβράνης συναντάμε τον κυτταροπλασματικό δακτύλιο. Ο κυτταροπλασματικός δακτύλιος, απαρτίζεται από έναν πρωτεϊνικό δακτύλιο και το πρωτεϊνικό σύμπλοκο με την ΑΤΡαση του συστήματος, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη σωστή λειτουργία του συστήματος και την αποτελεσματική έκκριση των πρωτεϊνών από αυτό.
Για τη δημιουργία και ενεργοποίηση του συστήματος περίπου 50 πρωτεΐνες πρέπει να συντονιστούν ώστε το σύστημα να αποκτήσει τη σωστή διαμόρφωση στο χώρο και οι πρωτεΐνες που πρόκειται να εκκριθούν από αυτό να μεταφερθούν εκεί. Η όλη διαδικασία υπόκειται πολύπλοκο και σύνθετο έλεγχο από διάφορους παράγοντες σε διάφορα επίπεδα, κατά το μονοπάτι εξόδου των πρωτεϊνών από το κύτταρο. Παρόλο που πάρα πολλές δομικές και βιοχημικές μελέτες έχουν συμβάλει στην κατανόηση και δομική ανάλυση του συστήματος, ελάχιστες πληροφορίες σχετικά με το μονοπάτι που ακολουθούν οι πρωτεΐνες με στόχο την έξοδό τους από το κύτταρο και τη ρύθμιση αυτού είναι γνωστές.
Βασικός στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η κατανόηση και αποσαφήνιση του μονοπατιού που ακολουθούν οι πρωτεΐνες οι οποίες πρόκειται να εκκριθούν, κατά τη μετατόπιση αυτών από το βακτηριακό κυτταρόπλασμα μέχρι τη μεμβράνη, στον πόρο εξόδου του συστήματος έκκρισης τύπου ΙΙΙ. Μέλημά μας ήταν ο εντοπισμός και χαρακτηρισμός των αλληλεπιδράσεων που συμβαίνουν ανάμεσα στις πρωτεΐνες του συστήματος και η χαρτογράφηση αυτών με στόχο τη διασαφήνιση του μηχανισμού που ακολουθείται κατά τη στόχευση των πρωτεϊνών στη μεμβράνη.
Για την επίτευξη του παραπάνω στόχου χρησιμοποιήθηκε σαν οργανισμός-μοντέλο το Εντεροπαθογόνο E. coll, και συνδυάστηκαν διάφορες βιοχημικές, δομικές και βιοφυσικές μεθοδολογίες.
Αρχικά πραγματοποιήθηκε μια περιεκτική και ολοκληρωμένη ανάλυση των πρωτεϊνικών συμπλόκων που εντοπίζονται στο βακτηριακό κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του βακτηρίου και την έκκριση των πρωτεϊνών από το σύστημα τύπου ΙΙΙ, συνδυάζοντας τεχνικές εγγενούς ηλεκτροφόρησης ή/ και χρωματογραφία μοριακής διήθησης, με υψηλής ευκρίνειας φασματομετρία μάζας.
Από την ανάλυση αυτή ταυτοποιήθηκαν πολλές πρωτεΐνες που σχετίζονται με το σύστημα έκκρισης τύπου ΙΙΙ. Επιπλέον, προέκυψαν σημαντικές πληροφορίες αναφορικά με τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα που δημιουργούνται στο κυτταρόπλασμα και πως ο σχηματισμός αυτών συνδέεται με τη ρύθμιση και λειτουργία του συστήματος, καθώς και με την σειρά που ακολουθείται κατά την διαδικασία της έκκρισης των πρωτεϊνών από το βακτήριο. Επιπλέον, αναπτύξαμε μια πειραματική διαδικασία η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση, τον προσδιορισμό και τη σύγκριση πρωτεϊνικών συμπλόκων σε οποιοδήποτε κύτταρο, κατά τη διάρκεια διαφορετικών φάσεων της ανάπτυξη αυτού.
Στα πλαίσια μιας πιο στοχευόμενης προσέγγισης, για την αποσαφήνιση των αλληλεπιδράσεων δυο πρωτεϊνών, χρησιμοποιήθηκε η σαπερόνη CesAB σε σύμπλοκο με την εκκριτική πρωτεΐνη EspA, και συνδυάστηκαν τόσο βιοχημικά, και βιοφυσικά πειράματα όσο και πειράματα in vivo.
Αρχικά χαρακτηρίστηκε η δομή της σαπερόνης μόνη της ή σε σύνδεση με την πρωτεΐνη EspA. Από το χαρακτηρισμό αυτό προέκυψε ότι η σαπερόνη σε μια προσπάθεια να αποτρέψει τον εαυτό της από μη ειδικές πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, αλληλεπιδρά με τον εαυτό της, μιμούμενη τον τρόπο που θα αλληλεπιδρούσε με την πρωτεΐνη EspA. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα, να παίρνει μια δομή στο χώρο σχεδόν όμοια με αυτή που έχει όταν βρίσκεται σε σύνδεση με την εκκριτική πρωτεΐνη EspA. Η μεγάλη διαφορά των δυο αυτών δομών είναι ότι όταν η σαπερόνη βρίσκεται σε σύνδεση με τον εαυτό της, το ομοδιμερές που προκύπτει έχει μια πιο χαλαρή δέσμευση και είναι μερικώς αναδιπλωμένο. Αυτό οφείλεται σε μη ευνοϊκές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο μορίων της σαπερόνης. Αποτέλεσμα αυτής της χαλαρής σύνδεσης είναι το γεγονός ότι αμέσως μετά την εισαγωγή της πρωτείνης EspA στο διάλυμα, το ομο-διμερές της σαπερόνης να διασπάται και ένα σταθερό και καλά αναδιπλωμένο ετερο-διμερές δημιουργείται μεταξύ της σαπερόνης CesAB και της εκκρινόμενης πρωτεΐνης EspA, με μοριακή αναλογία 1:1.
Επιπλέον, δείχθηκε ότι συγκεκριμένες αλλαγές στη στερεο-διαμόρφωση της σαπερόνης CesAB που προκύπτουν μετά από την πρόσδεση της πρωτείνης EspA, οδηγούν στη δημιουργία και έκθεση ενός σήματος στόχευσης στην ATPαση του συστήματος, την πρωτείνη EscN.
Συμπερασματικά, από τις δυο αυτές μελέτες προκύπτει ένας μηχανισμός κατά τον οποίο αρχικά η σαπερόνη «αυτορυθμίζεται» ώστε να αποτρέπει μη ειδικές αλληλεπιδράσεις στο κυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια, αφού αλληλεπιδράσει με το σωστό πρωτεϊνικό μόριο, την εκκρινόμενη πρωτείνη EspA, εκθέτει ένα σήμα στόχευσης ώστε να μπορέσει να αναγνωριστεί και να προσδεθεί το σύμπλοκο στην ATPαση του συστήματος. Η αλληλεπίδραση αυτή ρυθμίζεται με ένα μηχανισμό μετάβασης από μια μη αναδιπλωμένη κατάσταση με μια καλά αναδιπλωμένη κατάσταση (disorder-to-order state), και εξαρτάται αποκλειστικά από την πρωτείνη
EspA.
Τέλος, για τη διαλεύκανση του μηχανισμού στόχευσης των πρωτεϊνών στον πόρο μετατόπισης του συστήματος, απομονώθηκε το σύστημα και δημιουργήθηκε μια πειραματική διαδικασία κατά την οποία μπορούσαμε να μελετήσουμε την αλληλεπίδραση ή μη πρωτεϊνικών μορίων με τη μεμβράνη του βακτηρίου, in vitro.
Κατά τη διαδικασία αυτή, μελετήσαμε διαφορετικά πρωτεϊνικά μόρια της σαπερόνης CesAB, αγρίου τύπου ή μεταλλάγματα αυτής, ως προς την ικανότητά τους να προσδένονται στη μεμβράνη παρουσία ή απουσία της πρωτείνης EspA. Από την ανάλυση αυτή, προέκυψε ότι για την πρόσδεση του πρωτεϊνικού συμπλόκου στην μεμβράνη, απαραίτητο είναι το καρβοξυτελικό τμήμα της σαπερόνης CesAB. Επιπλέον, η πρόσδεση αυτή γίνεται μόνο παρουσία της εκκρινόμενης πρωτείνης EspA, αλλά όχι στην ATPαση του συστήματος, EscN. Η αλληλεπίδραση συμβαίνει με κάποιον άλλο πρωτεϊνικό υποδοχέα του συστήματος στον πόρο εξόδου, ενδεχομένως στην πρωτείνη EscU ή/ και στην EscV.
Συμπερασματικά, αναφορικά με τη διαδικασία στόχευσης των πρωτεϊνών στη μεμβράνη του βακτηρίου, με στόχο την έξοδο από αυτό, προτείνουμε το μοντέλο δυο φάσεων (two-step model). Κατά την πρώτη φάση, το πρωτεϊνικό σύμπλοκο, CesAB-EspA μεταφέρεται στη μεμβράνη του βακτηρίου και αλληλεπιδρά με τον πρωτεϊνικό υποδοχέα στην κυτταροπλασματική πλευρά της εσωτερικής μεμβράνης, στον πόρο μετατόπισης του συστήματος. Για την αλληλεπίδραση αυτή χρησιμοποιείται το σήμα στόχευσης στο καρβοξυτελικό άκρο της σαπερόνης CesAB. Η πρόσδεση αυτή του συμπλόκου στον πόρο μετατόπισης, έχει σαν αποτέλεσμα να έρχεται σε κοντινή απόσταση η ΑΤΡαση του συστήματος, η πρωτεΐνη EscN και να αλληλεπιδρά με το κεντρικό σώμα της σαπερόνης, στο οποίο βρίσκεται το δεύτερο σήμα στόχευσης (δεύτερη φάση).
|
Molecular analysis of protein secretion through Type III secretion system from Enteropathogenic E. coli
