| Περίληψη |
Περίπου 500 πρωτεΐνες του Escherichia coli εκκρίνονται μετα-μεταφραστικά από την μεταθετάση του κυττάρου (SecY-SecA). Οι εκκριτικές πρωτεΐνες αποτελούνται από το πεπτίδιο σήμα και το ώριμο μέρος. Τα δύο μέρη προσδένονται σε διακριτές θέσεις στη μεταθετάση. Στόχος της διατριβής είναι να βρούμε τα σήματα στόχευσης του ώριμου τμήματος για την μεταθετάση. Χρησιμοποιώντας διαφορετικές εκκριτικές πρωτεΐνες καταλήξαμε ότι ~100 αμινοξέα είναι ικανά προκειμένου να στοχευθεί μια πρωτεΐνη στη μεταθετάση. Στη συνέχεια χρησιμοποιώντας την αλκαλική φωσφατάση ως πρωτεΐνη μοντέλο, δημιουργήσαμε πρωτεΐνες-παράγωγά της- μικρότερες από 100 αμινοξέα. Η συγγένειά τους για τη μεταθετάση μειώνεται καθώς μειώνεται το μήκος τους. Επομένως ~100 αμινοξέα είναι αναγκαία για τη στόχευση. Οι μεγαλύτερες μειώσεις της συγγένειας συμπίπτουν με την αφαίρεση 2 υδρόφοβων νησίδων. Προκειμένου να εξετάσουμε αν οι νησίδες είναι σημαντικές για τη στόχευση, μεταλλάξαμε τα υδρόφοβα αμινοξέα δημιουργώντας αλληλουχίες ουδέτερης υδροφοβικότητας. Όταν 1. μεταλλάχθηκαν και οι δύο νησίδες και 2. το υπόστρωμα δεν έχει πεπτίδιο σήμα τότε χάνεται η συγγένεια της πρωτεΐνης για την μεταθετάση. Επομένως το ώριμο τμήμα πρέπει να έχει τουλάχιστον μια υδρόφοβη νησίδα προκειμένου να στοχευθεί. Οι πρωτεΐνες προκειμένου να είναι σταθερές στο κυτταρικό περιβάλλον και να μην κατακρημνίζονται, πρέπει να σχηματίσουν υδρόφοβο πυρήνα, να κρύψουν τα υδρόφοβα μέρη τους και επομένως να αναδιπλώσουν. Γνωρίζουμε οστώσο ότι μόνο οι αποδιπλωμένες πρωτεΐνες στοχεύονται και εκκρίνονται. Δημιουργείτε η απορία πώς οι εκκρινόμενες πρωτεΐνες καταφέρνουν να χρησιμοποιούν τις υδρόφοβες νησίδες τους και να στοχεύονται. Δοκιμάσαμε τη σταθερότητα των εκκριτικών πρωτεϊνών σε υδατικό διάλυμα. Το 50% παραμένει σταθερό και ικανό για στόχευση και έκκριση. Οι πρωτεΐνες προκειμένου να στοχευθούν πρέπει να είναι αποδιπλωμένες, επομένως καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι παραπάνω πρωτεΐνες παραμένουν εγγενώς αποδιπλωμένες. To υπόλοιπο 50% κατακρημνίζεται. Οστώσο το κύτταρο έχει πολλαπλές επιλογές για τις εκκρινόμενες πρωτεΐνες που κατακρημνίζονται. Τουλάχιστον 3 πρωτεΐνες (SecA, SecB, Trigger Factor) μπορούν να «σώσουν» τις εκρινόμενες πρωτεΐνες από την κατακρήμνιση αλλά και να τις διατηρήσουν ικανές για μετατόπιση. Οι κυτταροπλασματικές, έχουν υδρόφοβες νησίδες παρόμοιες με αυτές των εκκρινόμενων και προσδένονται στην μεταθετάση. Η διαφορά τους έγγειται στο ότι το χρονικό περιθώριο που παραμένουν ικανές για στόχευση είναι μικρότερο από των εκκρινόμενων. Καταλήγοντας τα σήματα στόχευσης είναι 1. Οι υδρόφοβες νησίδες και 2. Η τάση των εκκρινόμενων να παραμένουν αποδιπλωμένες.
Εξετάζοντας τα σήματα στόχευσης από την πλευρά της SecA, παρατηρήσαμε ότι υπάρχουν υδρόφοβες νησίδες στην κυτταροπλασματική πλευρά της SecA. Όταν ακινητοποιήσαμε την καρβοξυτελική ουρά της SecA σε μια από τις νησίδες, η συγγένεια στόχευσης των υποστρωμάτων έγινε 10 φορές μικρότερη . Επομένως η συγκεκριμένη περιοχή αν και φαίνεται να μην είναι μοναδική, είναι σημαντική για την πρόσδεση υποστρωμάτων.
Όταν ελέγξαμε αν το πεπτίδιο σήμα επηρεάζει τη στόχευση αντικαθιστώντας το πεπτίδιο σήμα της αλκαλικής φωσφατάσης με 30 άλλα πεπτίδια σήματα παρατηρήσαμε ότι οι διαφορές στη συγγένεια ήταν μικρές. Αντίθετα το πεπτίδιο σήμα είναι καθοριστικό για την αποτελεσματικότητα της έκκρισης και για τη μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης του ολοενζύμου (SecY-SecA).
|
Ο μοριακός μηχανισμός της στόχευσης των προ-πρωτεϊνών στα βακτήρια
