Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Μελέτη μηχανισμών περιφερικής ανοσολογικής ανοχής των CD8 T λεμφοκυττάρων σε νέο διαγονιδιακό μοντέλο TCR/αντιγόνο στο ποντίκι  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου uch.biology.phd//2006fousteri
Τίτλος Μελέτη μηχανισμών περιφερικής ανοσολογικής ανοχής των CD8 T λεμφοκυττάρων σε νέο διαγονιδιακό μοντέλο TCR/αντιγόνο στο ποντίκι
Άλλος τίτλος Studies on immunological tolerance of CD8 T lymphocytes in a new TCR (T cell receptor)/antigen transgenic mouse model
Συγγραφέας Φουστέρη, Γεωργία
Σύμβουλος διατριβής Μαμαλάκη, Κλεάνθη
Περίληψη Προκειμένου να μελετήσουμε πώς η απώλεια του ενδογενούς TNF επιδρά στην ανοχή των CD8+ Τ λεμφοκυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ένα καλά χαρακτηρισμένο διαγονιδιακό για τον υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (TCR) ποντίκι, το F5. Τα κύτταρα που φέρουν τον F5 υποδοχέα αναγνωρίζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο, το ΝΡ, που προέρχεται από την νουκλεοπρωτεΐνη του ιού της γρίππης. Στο εργαστήριο δημιουργήσαμε μία νέα διαγονιδιακή σειρά για το αντιγόνο ΝΡ, την pNP31. Η σειρά αυτή κατασκευάστηκε με κλωνοποίηση του υποκινητή pdx-1 μπροστά από το γονίδιο ΝΡ. Έλεγχος με RT-PCR έδειξε ότι το αντιγόνο ΝΡ εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του παγκρεατικού. Τα δύο πρώτα χρόνια της διδακτορικής μου διατριβής πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοχής χρησιμοποιώντας το πειραματικό σύστημα στης ενδοφλέβιας μεταφοράς F5 κυττάρων σε ποντίκια-αποδέκτες pNP31. Δοκιμάστηκαν διάφορες συνθήκες μεταφοράς και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της λειτουργικής κατάστασης του παγκρέατος των ζώων ήταν η καμπύλη ανοχής στη γλυκόζη και ο ιστολογικός έλεγχος. Απώλεια ανοχής στη γλυκόζη παρατηρήθηκε περισσότερο στα αρσενικά και λιγότερο στα θηλυκά και πραγματοποιήθηκαν τόσο στο Rag1+/+ όσο και στο knockout υπόβαθρο. Σε δύο από περισσότερες από 100 μεταφορές του τύπου: F5/TNF-/- ή F5->pNP31/TNF-/- που παρακολουθήθηκαν συστηματικά εμφάνισαν διαβήτη, αριθμός μικρός, για να μπορέσει να χρησιμοποιηθεί αυτή η πειραματική προσέγγιση περαιτέρω για την προαγωγή διαβήτη και τη μελέτη του ρόλου του TNF στην απώλεια της ανοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Παράλληλα, νέα διπλά διαγονιδιακά ποντίκια δημιουργήθηκαν με την απευθείας διασταύρωση των pNP31 ποντικών με τα F5 TCR διαγονιδιακά, τα οποία υπήρχαν σε Rag1 και TNF knockout γενετικά υπόβαθρα. Το αποτέλεσμα ήταν ενδιαφέρον, καθώς περίπου 40% των ποντικών στα οποία απουσίαζε ο ενδογενής TNF ανέπτυξαν διαβήτη, ενώ τα αντίστοιχα στα οποία ο TNF ήταν παρόν μόνο 1 από περισσότερα από 60 που ελέγχθηκαν παρέμειναν σε κατάσταση ανοχής. Επομένως το πειραματικό σύστημα ήταν κατάλληλο για τη μελέτη της ανοχής των CD8+ T λεμφοκυττάρων απουσία του ενδογενούς TNF, με άμεση συνάφεια με την ανάπτυξη αντοάνοσης πάθησης (διαβήτη τύπου 1). Τα ποντίκια με εμφανή διαβήτη επίσης εμφάνιζαν έντονη διήθηση του παγκρεατικού ιστού. Η απώλεια ανοχής στα F5/pNP31/TNF-/- διαβητικά ποντίκια συνοδεύτηκε με αύξηση των συνολικών CD8+ Τ κυττάρων. Επομένως ένα σημαντικό μέρος των F5/pNP31/TNF-/- ποντικών ανέπτυξε διαβήτη. Το γεγονός ότι όχι όλα τα ποντίκια ανέπτυξαν ασθένεια είναι ενδιαφέρον και θυμίζει άλλα μοντέλα inbred ποντικών που εμφανίζουν αυτόματα διαβήτη, όπως το NOD. Πιθανόν περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως για παράδειγμα διαφορές στη μικροχλωρίδα του εντέρου ή επαφές με διαφορετικά ανοσογόνα ανά ποντικό, παίζουν ρόλο. Επιπρόσθετα, μικρές διαφορές στα γενετικά υπόβαθρα ανά άτομο εξαιτίας του τρόπου διασταύρωσης που ακολουθήθηκε για την παραγωγή της τετραπλά διαγονιδιακής σειράς, μπορεί να οφείλονται για το γεγονός που η διεσδυτικότητα της νόσου δεν είναι 100%. Ωστόσο, αυτό το δεδομένο φέρνει το μοντέλο κοντά στα τρέχοντα δεδομένα για την ανάπτυξη διαβήτη και άλλων αυτοάνοσων ασθενειών στον άνθρωπο. Μία έντονη διαφορά που παρατηρήσαμε αρχικά στα F5/pNP31 ποντίκια στα οποία ο ενδογενής TNF ήταν παρόν, ήταν ότι είχαν σχεδόν 3 φορές μείωση του αριθμού των συνολικών CD8+ Τ λεμφοκυττάρων τους στο σπλήνα. Αυτή η ανοχή μέσω απαλοιφής χάθηκε σε μεγάλο βαθμό στα ποντίκια στα οποία ο ενδογενής TNF απουσίαζε και είχαν αναπτύξει εμφανή διαβήτη. Αυτόματη ενεργοποίηση των CD8+ T λεμφοκυττάρων παρουσία του αυτο-αντιγόνου ΝΡ. Αρχικά θέλαμε να κατανοήσουμε αν τα CD8+ T λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται στα F5/pNP31 ποντίκια και αν υπάρχουν διαφορές μεταξύ των ποντικών που ανέπτυξαν διαβήτη απουσία του TNF ή όχι. Για αυτό το σκοπό απομονώσαμε κύτταρα από τους παγκρεατικούς λεμφαδένες και τους σπλήνες από όλες τις κατηγορίες ποντικών: F5, F5/TNF-/-, F5/pNP31, F5/pNP31/TNF-/- (και διαβητικά) και τα αναλύσαμε για τους κυτταρικούς μάρτυρες ενεργοποίησης: CD25, CD44, CD69, και CD62L. Βρήκαμε ότι τα CD8+ T κύτταρα προερχόμενα είτε από ΤΝF+/+ είτε από TNF-/- F5/pNP31 ποντίκια, εμφάνισαν σημαντική αύξηση των CD44, CD69 μαρτύρων, πολύ μικρότερη του CD25, και μείωση της έκφρασης του CD62L. Επομένως, η παρουσία του αντιγόνου ΝΡ οδηγεί στη αυτόματη ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Αναστροφή της ανέργειας των F5 Τ κυττάρων απουσία του ενδογενούς TNF. Στη συνέχεια, θελήσαμε να μελετήσουμε αν η ειδική για το αντιγόνο ΝΡ δραστικότητα των κυττάρων που δεν είχαν απαλειφθεί στα F5/pNP31 ποντίκια είχε επηρεαστεί απουσία του ενδογενούς TNF. Για αυτό το σκοπό απομονώθηκαν κύτταρα από το σπλήνα των ποντικών και η ικανότητα τους πολλαπλασιασμού σε επανα-πρόκληση στο αντιγόνο μελετήθηκε in vitro. Βρήκαμε ότι η πολλαπλασιαστική ικανότητα είχε αυξηθεί ειδικά σε αυτό το τμήμα των ποντικών που ήταν TNF knockout και εμφάνιζαν διαβήτη. Επίσης αναλύσαμε την ικανότητα των κυττάρων να παράγουν IFNγ (με FACS) κατόπιν ΝΡ επανα-διέγερσης. Στα F5/pNP31 ποντίκια η ικανότητα αυτή είχε σχεδόν χαθεί εντελώς (είχαν περιέλθει σε κατάσταση ανέργειας τα εναπομείναντα CD8+ T λεμφοκύτταρα). Στα F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια, τα κύτταρα που προέρχονταν τόσο από τους σπλήνες, όσο και από τους παγκρεατικούς λεμφαδένες, η παραγωγή της IFNγ ήταν πολύ υψηλή. Τα δεδομένα είναι σημαντικά, όπως βεβαιώθηκαν μέσω στατιστικής ανάλυσης. Επομένως, απουσία του ενδογενούς TNF η ανέργεια των CD8+ T λεμφοκυττάρων αναστράφηκε. Τέλος, μελετήσαμε την in vivo ικανότητα των CD8+ T λεμφοκυττάρων να σκοτώνουν κύτταρα προερχόμενα από C57Bl/10 ποντίκια βαμμένα με τη χρωστική CFSE και φορτωμένα με το ΝΡ αντιγόνο. Σε συμφωνία με τα δεδομένα του πολλαπλασιασμού και της παραγωγής IFNγ, τα αποτελέσματα δείχνουν αυξημένη και σημαντική κυτταροτοξικότητα στα F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια σε σύγκριση με τα TNF+/+. Είναι ενδιαφέρον να παρατηρήσουμε ότι και τα F5/ΤNF-/- παρουσίασαν σημαντικό βαθμό κυτταροτοξικότητας η οποία ήταν ειδική για το αντιγόνο ΝΡ. Μικρότερος βαθμός απόπτωσης στα διαβητικά F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια. Τέλος, θελήσαμε να μελετήσουμε την υπόθεση, αν η απουσία του ενδογενούς TNF από τη γέννηση των ποντικών, θα μπορούσε να οδηγήσει σε μικρότερο βαθμό απόπτωσης στα ποντίκια που εκφράζουν το ΝΡ αντιγόνο, το οποίο θα μπορούσε μαζί με τα δεδομένα της δοκιμασίας πολλαπλασιασμού να ερμηνεύσει τους αυξημένους αριθμούς των CD8+ T κυττάρων και το μικρότερο βαθμό απαλοιφής σε αυτά τα ποντίκια. Πράγματι, η απόπτωση ήταν μειωμένη στα διαβητικά F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια, το οποίο προσδίδει στο σύστημα μία μηχανιστική εξήγηση γιατί υπάρχουν αυξημένοι αριθμοί κυττάρων στα διαβητικά και ίσως γιατί η ανοχή χάθηκε σε αυτά τα ποντίκια: είχαν μειωμένο θάνατο μετά από ενεργοποίηση in vivo. Συμπεράσματα. Η έκφραση του αντιγόνου ΝΡ οδηγεί σε αυθόρμητη ενεργοποίηση των CD8+ T κυττάρων στα F5/pNP31 διαγονδιακά ποντίκια. Τα κύτταρα συναντώντας το αντιγόνο για το οποίο είναι ειδικά πεθαίνουν μέσω απόπτωσης παρουσία TNF, με αποτέλεσμα ο συνολικός τους αριθμός να είναι μειωμένος (ανοχή μέσω απαλοιφής). Απουσία TNF, o θάνατος μετά από ενεργοποίηση είναι μειωμένος, οδηγώντας σε λιγότερη απόπτωση, λιγότερη απαλοιφή και εμφάνιση διαβήτη τύπου 1 σε ένα σημαντικό τμήμα ποντικών, παρουσία του αντιγόνου ΝΡ. Διακυμάνσεις στα δεδομένα μεταξύ των ποντικών φαίνεται να συνδέονται με την ανάπτυξη της ασθένειας. Η ύπαρξη του Rag1-/- γενετικού υποβάθρου είναι απαραίτητη για την διεισδυτικότητα της νόσου, πιθανόν γιατί είναι γνωστό ότι λεμφοπενία μπορεί να οδηγήσει στην αυτοανοσία. Επιπρόσθετα, η ανέργεια των CD8+ T κυττάρων τα οποία δεν είχαν απαλειφθεί, αντιστράφηκε απουσία του ενδογενούς TNF, μια και ακόμα και τα μη διαβητικά F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια είχαν αυξημένη ικανότητα παραγωγής IFNγ. Επομένως, ο TNF αποτελεί ένα σημαντικό ρυθμιστή της ανοχής σε αντιγόνα εαυτού, επιδρώντας στο θάνατο που προάγεται από την ενεργοποίηση και ακόμα πιο σημαντικά στη διατήρηση της ανέργειας των CD8+ T κυττάρων.
Γλώσσα Ελληνικά
Ημερομηνία έκδοσης 2006-03-03
Ημερομηνία διάθεσης 2006-04-17
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 61

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 9