Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Μελέτη των μηχανισμών δράσης των νεότερων αντιπρωτεϊνουρικών θεραπειών στη διαβητική νεφροπάθεια  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000386325
Τίτλος Μελέτη των μηχανισμών δράσης των νεότερων αντιπρωτεϊνουρικών θεραπειών στη διαβητική νεφροπάθεια
Άλλος τίτλος Study of the mechanisms of action of new antiproteinuric agents in diabetic nephropathy
Συγγραφέας Μαυροειδή, Βασιλική Ν
Σύμβουλος διατριβής Παπαβασιλείου, Ε
Γανωτάκης, Ε
Δαφνής, Ε
Περίληψη Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου Ι αποτελεί μια από τις πιο συχνές παθήσεις που πλήττουν την παιδική ηλικία παγκοσμίως. Η υπεργλυκαιμία, που προκύπτει από την καταστροφή των β κυττάρων του παγκρέατος, αποτελεί το εναρκτήριο ερέθισμα για μια [104] σειρά από επιπλοκές, που πλήττουν όργανα- στόχους μεταξύ αυτών και ο νεφρός. Η πρόσληψη της γλυκόζης από τα κύτταρα του νεφρού δεν εξαρτάται από την ινσουλίνη, αντίθετα η γλυκόζη διαχέεται σύμφωνα με το πρανές της συγκέντρωσης, με τα ενδοκυττάρια επίπεδα γλυκόζης να αυξάνονται αναλόγως με το βαθμό της υπεργλυκαιμίας. Μια σειρά από μεταβολικές αλλαγές και αιμοδυναμικό stress επάγουν την έκκριση κυττοκινών και αυξητικών παραγόντων που τελικά διαμεσολαβούν τη νεφρική βλάβη στο σακχαρώδη διαβήτη, όπως αυτή εκδηλώνεται με την υπερτροφία των κυττάρων του νεφρού, την εναπόθεση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και τη βλάβη του ποδοκυττάρου. Καθώς η πάθηση εξελίσσεται, η απέκκριση της λευκωματίνης στα ούρα αυξάνεται. Το Σύστημα Ρενίνης Αγγειοτασίνης (ΣΡΑ) διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της διαβητικής νεφροπάθειας. Στη διαβητική νεφροπάθεια, το συστηματικό ΣΡΑ είναι κατεσταλμένο ενώ το ενδονεφρικό είναι ενεργοποιημένο και εμπλέκεται στην παθογένεση της νεφρικής βλάβης όπως έχει διαπιστωθεί τόσο σε πειραματικά μοντέλα διαβήτη όσο και σε βιοψίες νεφρού ασθενών με διαβητική νεφροπάθεια. Σε σπειράματα πειραματοζώων με σακχαρώδη διαβήτη, έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα αγγειοτασινογόνου και αγγειοτασίνης ΙΙ σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Μάλιστα, η εξωγενής χορήγηση αγγειοτασίνης Ι στα σπειράματα, οδηγούσε σε αυξημένη σύνθεση αγγειοτασίνης ΙΙ, στα σπειράματα των διαβητικών πειραματοζώων. Σε βιοψίες νεφρού ασθενών με διαβητική νεφροπάθεια, έχει βρεθεί αυξημένη έκφραση του μετατρεπτικού ενζύμου σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Επιπλέον, το σπείραμα και συγκεκριμένα το ποδοκύτταρο κατέχουν κεντρική θέση στην παθοφυσιολογία της διαβητικής νεφροπάθειας. Πειραματικά δεδομένα από κυτταροκαλλιέργειες, συνδέουν την αγγειοτασίνη II με αυξημένη δραστηριότητα mTOR. Το μονοπάτι PI3K- AKT- mTOR εμπλέκεται στην ανάπτυξη νεφρικής βλάβης στο σακχαρώδη διαβήτη. Εχει βρεθεί ότι η AKT και η mTOR είναι ενεργοποιημένες στη διαβητική νεφροπάθεια, διαμεσολαβώντας τις παθολογοανατομικές βλάβες. Η mTOR, μια κινάση σερίνης-θρεονίνης, αποτελεί [105] συνιστώσα 2 ξεχωριστών πολυπρωτεινικών σηματοδοτικών συμπλεγμάτων (mΤΟRC1, mTORC2). Αυξητικοί παράγοντες και αμινοξέα ενεργοποιούν την κινάση των φωσφο-ινοσιτιδίων-3-ΟΗ (PI3K) που φωσφορυλιώνει την PIP2 προς PIP3, που, εν συνεχεία, ενεργοποιεί την PDK1. Η PDK1 ενεργοποιεί την AKT, μέσω φωσφορυλίωσης στην θέση Thr308 (pAKT308). Η ΑΚΤ είναι βασικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού, της επιβίωσης και της αύξησης των κυττάρων. Η ενεργοποιημένη AKT οδηγεί σε ενεργοποίηση του mΤΟRC1, αίροντας μια σειρά από ανασταλτικά σήματα, μέσω του συστήματος της οζώδους σκλήρυνσης (tuberous sclerosis system –TSC complex). Η AKT μπορεί, επίσης, να ενεργοποιήσει απευθείας το mΤΟRC1, φωσφορυλιώνοντας την mTOR στη θέση Ser2448 (pTOR2448), χωρίς να παρεμβληθεί το σύμπλοκο της οζώδους σκλήρυνσης. Η AMPK ενεργοποιείται σε συνθήκες χαμηλών επιπέδων γλυκόζης και καταστέλλει το mΤΟRC1, και επομένως εξασφαλίζει ότι, σε συνθήκες έλλειψης ενέργειας, ενεργοβόρες διεργασίες μέσα στο κύτταρο αναστέλλονται. Επιπλέον, τo mTORC2 φωσφορυλιώνει την ΑΚΤ στην θέση Ser473 (pAKT473). Μέχρι τώρα, δεν υπάρχουν στη βιβλιογραφία δεδομένα σχετικά με την επίδραση της αντιπρωτεϊνουρικής θεραπείας λοσαρτάνης στο σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K- AKT- mTOR σε ένα in vivo μοντέλο διαβητικής νεφροπάθειας τύπου Ι. Επομένως, σε ένα πειραματικό μοντέλο διαβητικής νεφροπάθειας τύπου I μετά από χορήγηση λοσαρτάνης, διερευνήθηκαν τα εξής: Α) Το περιεχόμενο της ολικής AKT, pAKT308, pAKT473, mTOR και pTOR2448, στο σπείραμα. Β) Το περιεχόμενο ολικής AKT, pAKT308, pAKT473, mTOR και pTOR2448 στο επίπεδο του ποδοκυττάρου, πραγματοποιώντας πειράματα συνεντόπισης με τον ειδικό ποδοκυτταρικό δείκτη νεφρίνη. Γ) Το πάχος της βασικής μεμβράνης του σπειράματος και η έκταση του μεσαγγείου Δ) Κλινικές και βιοχημικές παράμετροι των πειραματοζώων όπως είναι η συστολική αρτηριακή πίεση και η απέκκριση λευκωματίνης στα ούρα 24ώρου. Στην παρούσα μελέτη, προκειμένου να διερευνηθούν τα ανωτέρω ερωτήματα, αρουραίοι Sprague-Dawley έγιναν διαβητικοί με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση [106] στρεπτοζοτοκίνης. Τρεις ημέρες μετά τη χορήγηση της στρεπτοζοτοκίνης, έγινε μέτρηση γλυκόζης αίματος και τα πειραματόζωα με γλυκόζη αίματος>350mg/dl, συμπεριελήφθησαν στη μελέτη. Στα διαβητικά πειραματόζωα χορηγείτο κάθε δεύτερη μέρα ινσουλίνη glargine, υποδορίως, σε δόση εξατομικευμένη με στόχο γλυκόζη αίματος μεταξύ 350 έως 500 mg/dl. Μια φορά το μήνα, τα πειραματόζωα τοποθετούνταν σε ειδικούς μεταβολικούς κλωβούς, με σκοπό τη συλλογή ούρων 24ώρου. Κατά τη διάρκεια της συλλογής, οι αρουραίοι είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και τροφή. Τα ούρα που συλλέγονταν προορίζονταν για τη μέτρηση της λευκωματίνης. Πέντε μήνες μετά την επαγωγή του σακχαρώδους διαβήτη, τα πειραματόζωα χωρίσθηκαν σε 4 ομάδες: διαβητικά πειραματόζωα, διαβητικά πειραματόζωα υπό λοσαρτάνη διαλυμένη στο πόσιμο νερό, υγιείς μάρτυρες και υγιείς μάρτυρες υπό λοσαρτάνη διαλυμένη στο πόσιμο νερό. Δύο μήνες μετά την έναρξη της χορήγησης της λοσαρτάνης τα πειραματόζωα τοποθετήθηκαν σε ειδικούς μεταβολικούς κλωβούς για συλλογή ούρων 24ώρου με σκοπό τη μέτρηση της απέκκρισης της λευκωματίνης. Επίσης, έγινε μέτρηση της συστολικής πίεσης αφού είχε γίνει ο απαραίτητος εγκλιματισμός των πειραματοζώων στο σύστημα μέτρησης της αρτηριακής πίεσης. Μετά, διενεργήθηκε ευθανασία με χορήγηση νατριούχου πεντοβαρβιτάλης και τα πειραματόζωα θυσιάσθηκαν με αφαίμαξη. Οι νεφροί απομονώθηκαν και αφού ζυγίσθηκαν, τμήματα αυτών υπέστησαν διαφορετική επεξεργασία με σκοπό τη διενέργεια διαφορετικών τεχνικών. Ένα τμήμα αυτών χρησιμοποιήθηκε για απομόνωση σπειραμάτων με τη μέθοδο των διαδοχικών ηθμών διαφορετικής διαμέτρου πόρου. Συγκεκριμένα, αφού ο νεφρικός φλοιός πολτοποιήθηκε, διηθήθη πρώτα από το φίλτρο των 150μm, πάνω στο οποίο συγκρατήθηκαν αγγεία και σωληνάρια και διήλθε το υλικό που περιείχε τα σπειράματα. Εν συνεχεία, στο φίλτρο των 106μm, ο ιστός που συγκεντρώθηκε υπέστη εκτεταμένες πλύσεις με αποτέλεσμα να διέλθουν τα σπειράματα. Στο φίλτρο των 106μm, ο ιστός που παρέμεινε ήταν σωληναριακός. Τέλος, στο φίλτρο των 75μm, τα σπειράματα που συλλέχθηκαν υπέστησαν πλύσεις με φυσιολογικό ορό, ώστε να απορριφθούν μικρά τμήματα σωληναρίων. Αφού, ελέγχθηκε, στο οπτικό μικροσκόπιο, η καθαρότητα του [107] σπειραματικού υλικού και διαπιστώθηκε πως αυτή ήταν >95%, αυτό τοποθετήθηκε σε διάλυμα λύσης με σκοπό τη μελέτη του, με τη μέθοδο ανοσοστυπώματος κατά Western (Western blot). Για τη Western blot, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα Akt pAb, Ser473 pAkt mAb, Thr308 pAkt mAb και τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα. Επίσης, τμήμα των νεφρών εμβαπτίσθηκε ταχέως σε υγρό άζωτο και μετά φυλάχθηκε στους -800C μέχρι να διενεργηθεί ο έμμεσος ανοσοφθορισμός. Για τον έμμεσο ανοσοφθορισμό χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή αντισώματα έναντι της ολικής AKT, pAKT308, pAKT473, mTOR, pTOR2448 και νεφρίνης και τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα. Το τεμάχιο του νεφρού που προοριζόταν για πειράματα φωτομικροσκοπίας και εκτίμηση της έκτασης του μεσαγγείου εμβαπτίσθηκε σε διάλυμα ουδέτερης φορμόλης 10%. Τέλος, το τμήμα του νεφρού που προοριζόταν για μελέτη με ηλεκτρονική μικροσκοπία και μέτρηση του πάχους της βασικής μεμβράνης όλων των ανοικτών αγκυλών τριχοειδών των σπειραμάτων εμβαπτιζόταν σε διάλυμα γλουταραλδεϋδης 5% v/v σε 0.1M ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων. Από την ανωτέρω μελέτη, σε ό,τι αφορά τις κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους των πειραματοζώων, προέκυψαν τα εξής: Παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση της απέκκρισης λευκωματίνης ανά 24ωρο στα ούρα των διαβητικών πειραματοζώων από την επαγωγή του σακχαρώδους διαβήτη μέχρι τον 5ο μήνα της παρακολούθησής τους. Η χορήγηση λοσαρτάνης προκάλεσε μείωση της λευκωματινουρίας στα διαβητικά πειραματόζωα. Σε σχέση με τη μέτρηση της αρτηριακής πίεσης των πειραματοζώων, διαπιστώθηκε ότι ο σακχαρώδης διαβήτης προκάλεσε αύξηση στη συστολική αρτηριακή πίεση, ενώ η λοσαρτάνη δεν είχε καμία επίδραση στη συστολική αρτηριακή πίεση των διαβητικών πειραματοζώων κάτι το οποίο υποδεικνύει ότι οι ευεργετικές επιδράσεις της λοσαρτάνης στο διαβήτη δεν είναι μόνο συνέπεια της επίδρασης της στην αιμοδυναμική ισορροπία του σπειράματος. Σε ό,τι αφορά την εκτίμηση της έκτασης του μεσαγγείου, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση του μεσαγγείου, στα διαβητικά πειραματόζωα σε σχέση με τα υγιή. Ως συνέπεια της επίδρασης της λοσαρτάνης στα διαβητικά πειραματόζωα, [108] διαπιστώθηκε τάση για μείωση της έκτασης του μεσαγγείου χωρίς να προκύψει στατιστική σημαντικότητα. Η λοσαρτάνη μείωσε την, προκαλούμενη από το σακχαρώδη διαβήτη, πάχυνση της βασικής μεμβράνης του σπειράματος. Σε ό,τι αφορά τα πειράματα του έμμεσου ανοσοφθορισμού, επωάσθηκαν κρυοτομές νεφρικού ιστού με πρωτογενή αντισώματα έναντι της ολικής AKT, pAKT308, pAKT473, mTOR, pTOR2448 και νεφρίνης. Διαπιστώθηκε ότι σε επίπεδο σπειράματος, ο σακχαρώδης διαβήτης προκάλεσε αύξηση των pAKT308, mTOR και pTOR2448, ευρήματα σε ευθυγράμμιση με την υπόλοιπη βιβλιογραφία. Η χορήγηση λοσαρτάνης στα διαβητικά πειραματόζωα προκάλεσε μείωση της mTOR, pTOR2448 και των ενεργοποιημένων μορφών της AKT, pAKT308 και pAKT473, ενώ αύξησε τα επίπεδα της ολικής AKT. Είναι προφανές πως η λοσαρτάνη στα διαβητικά πειραματόζωα αντέστρεψε τη σηματοδότηση που οδηγούσε σε ενεργοποίηση της AKT και της mTOR. Ο ειδικός ποδοκυτταρικός δείκτης νεφρίνη χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα συνεντόπισης με τα ανωτέρω υπό μελέτη μόρια. Σε επίπεδο ποδοκυττάρου, παρατηρήθηκε ότι ο σακχαρώδης διαβήτης προκάλεσε αύξηση στην ολική AKT, pAKT308 και pTOR2448, κάτι που υποδεικνύει ενεργοποίηση του μονοπατιού παρά τη μείωση της mTOR και της pAKT473. Η λοσαρτάνη στα διαβητικά πειραματόζωα, παρά την αύξηση της ποδοκυτταρικής mTOR, ουσιαστικά μείωσε το βαθμό ενεργοποίησής της, όπως αυτό τεκμηριώνεται από τη μείωση της pTOR2448. Τα επίπεδα της ολικής ΑΚΤ και pAKT473, στα ποδοκύτταρα των διαβητικών πειραματοζώων, δεν άλλαξαν ως συνέπεια της χορήγησης λοσαρτάνης. Στα ποδοκύτταρα των υγιών πειραματοζώων υπό λοσαρτάνη παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων της pTOR2448 σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, το αντίθετο από ότι διαπιστώθηκε για τις ομάδες των διαβητικών επίμυων. Αυτό υποδεικνύει διαφορετική δράση της λοσαρτάνης στα ποδοκύτταρα, ανάλογα με την ύπαρξη ή όχι σακχαρώδους διαβήτη. Οι διαφορές που διαπιστώθηκαν στις πρωτείνες στο επίπεδο του σπειράματος και των ποδοκυττάρων πιθανώς αντιπροσωπεύουν έναν διαφορετικό τρόπο ρύθμισης της σηματοδότησης σε ξεχωριστά [109] τμήματα του σπειράματος. Εφόσον το σπείραμα αποτελείται από τρείς διαφορετικούς τύπους κυττάρων οι ανωτέρω παρατηρούμενες διαφοροποιήσεις, είναι δυνατόν να αποδοθούν σε διαφορετική επίδραση του διαβήτη και/ή της λοσαρτάνης σε αυτούς τους κυτταρικούς πληθυσμούς. Τα αποτελέσματα της Western blot επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα του ανοσοφθορισμού, κάτι που ισχυροποιεί τα δεδομένα ακόμα περισσότερο. Συμπερασματικά, η λοσαρτάνη μείωσε την απέκκριση λευκωματίνης στα ούρα 24ώρου, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στην αρτηριακή πίεση των διαβητικών πειραματοζώων. Παράλληλα, σε ό,τι αφορά τη βασική μεμβράνη του σπειράματος, η λοσαρτάνη αντέστρεψε την, προκαλούμενη από το σακχαρώδη διαβήτη, πάχυνσή της. Αναφορικά με το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K- AKT- mTOR, διαπιστώθηκε διαφορετική ρύθμιση της ενεργοποίησής του σε σπειράματα και ποδοκύτταρα ως συνέπεια της επίδρασης του σακχαρώδους διαβήτη και της λοσαρτάνης. Το μονοπάτι PI3K- AKT- mTOR εμπλέκεται στην παθογένεση της νεφρικής βλάβης στο διαβήτη, μέσω πρόκλησης υπερτροφίας των κυττάρων και παραγωγής εξωκυττάριας ουσίας. Η λοσαρτάνη επηρεάζει τα επίπεδα των πρωτεϊνών του με ευεργετικό τρόπο, υποδηλώνοντας διασταυρούμενη επικοινωνία μεταξύ του συστήματος ρενίνης αγγειοτασίνης και του μονοπατιού PI3K- AKT- mTOR.
Φυσική περιγραφή 132,{12} : πιν. ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Podocyte
Renin-angiotensin system
Ποδοκύτταρο
Σπείραμα
Σύστημα Ρενίνης-Αγγειοτασίνης
Ημερομηνία έκδοσης 2014-07-24
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 86

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Δεν έχετε δικαιώματα για να δείτε το έγγραφο.
Δεν θα είναι διαθέσιμο έως: 2017-07-24