Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Μελέτη του φαινομένου της αντοχής του πρωτόζωου παράσιτου Leishmania στα φάρμακα με τη σύγκριση δομικών και βιολογικών χαρακτηριστικών ευαίσθητων και ανθεκτικών στελεχών  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000373206
Τίτλος Μελέτη του φαινομένου της αντοχής του πρωτόζωου παράσιτου Leishmania στα φάρμακα με τη σύγκριση δομικών και βιολογικών χαρακτηριστικών ευαίσθητων και ανθεκτικών στελεχών
Άλλος τίτλος Study of the drug resistant phenomenon of Leishmania parasites,correlating structural and biological characteristics of sensitive and resistant isolates.
Συγγραφέας Μεσσαριτάκης Ιπποκράτης
Μέλος κριτικής επιτροπής Καραγωγέως, Δόμνα
Τσιώτης, Γεώργιος
Γεωργούλιας, Βασίλειος
Σαμώνης, Γεώργιος
Περγαντής, Σπύρος
Κοφτερίδης, Διαμαντής
Σύμβουλος διατριβής Αντωνίου Μαρία
Περίληψη Η Leishmania είναι ένα Πρωτόζωο παράσιτο που αποτελεί το αίτιο μιας ομάδας ασθενειών, των λεϊσμανιάσεων (Ross, 1903). Μεταδίδονται μέσω του ασπόνδυλου αιματοφάγου ενδιάμεσου ξενιστή, της σκνίπας και είναι ανθρωπονόσοι ή ζωονόσοι (Killick-Kendrick, 1999). Οι λεϊσμανιάσεις αποτελούν ένα σημαντικό πρόβλημα για τη δημόσια υγεία καθώς ο αριθμός των κρουσμάτων συνεχώς αυξάνεται. Η οικονομική ανάπτυξη, οι κλιματολογικές και περιβαλλοντικές αλλαγές που ευνοούν την μετακίνηση των εντόμων - φορέων σε χώρες που μέχρι πρόσφατα δεν υπήρχαν, η αυξημένη μετανάστευση από ενδημικές χώρες αλλά και ο αυξημένος αριθμός ταξιδιωτών παγκοσμίως έχει συντελέσει στο φαινόμενο αυτό (Dujardin, 2008). Η σπλαχνική λεϊσμανίαση (ΣΑ) είναι η πιο σοβαρή μορφή της νόσου και είναι θανατηφόρα στο 95% των περιπτώσεων αν δεν δοθεί έγκαιρα θεραπεία. Μπορεί να προκληθεί από την Leishmania infantum ή την L. donovani του «Παλαιού Κόσμου». Τα δυο είδη του παράσιτου διαφέρουν στην εκδήλωση της ασθένειας, στους μεταβιβαστές και στους σπονδυλωτούς ξενιστές που χρησιμοποιούν και στη γεωγραφική τους κατανομή. Ανησυχητικό είναι το γεγονός ότι το παράσιτο Leishmania έχει αναπτύξει αντοχή στα αντιμονιούχα φάρμακα (φάρμακα 1ης γραμμής για την θεραπεία της νόσου). Τα τελευταία χρόνια έχουν ανακαλυφθεί φάρμακα και σχήματα τα οποία προσφέρουν βελτιωμένη θεραπεία από την ασθένεια (Murray, 2004). Η θεραπεία 1ης γραμμής περιλαμβάνει τη χρήση της λιποσωμικής Αμφοτερικίνης Β (AmB) η οποία, παρά την υψηλή αποτελεσματικότητά της, μπορεί να παρουσιάσει σοβαρές παρενέργειες (Ashford, 2000). Επιπρόσθετα, μια νέα δραστική ουσία, η hexadecyl phosphocholine (Miltefosine), αντιπροσωπεύει τον πρώτο αναγνωρισμένο αντι-λεϊσμανιακό παράγοντα με αποτελεσματική χορήγηση per os (www.virbac.gr; Sundar, 2002). Το φαινόμενο της πολλαπλής αντοχής στα φάρμακα (multi drug resistance, MDR), η ικανότητα δηλαδή που έχει ένα ζωντανό κύτταρο να εμφανίζει ανθεκτικότητα σε μια μεγάλη ποικιλία από δομικά και λειτουργικά ανόμοια σκευάσματα, αντιπροσωπεύει μία σημαντική δυνατότητα κάποιων μονοκυττάριων οργανισμών και κυττάρων των θηλαστικών (Singh, 2006). Η ικανότητα αυτή είναι εμπόδιο στη θεραπεία όχι μόνο της λεϊσμανίασης αλλά και άλλων ασθενειών και καρκίνων και η κατανόηση του φαινόμενου θα βοηθήσει στην καλύτερη αντιμετώπισή τους. Καρκινικά κύτταρα που έχουν αναπτυχθεί σε καλλιέργειες στο εργαστήριο και διάφορα παράσιτα που εμφανίζουν το MDR, φαίνεται να υπερεκφράζουν μια διαμεμβρανική αντλία εκροής, την P - γλυκοπρωτεϊνη μεγέθους 170kDa (Pgp -170), η οποία έχει την ικανότητα να αντλεί από το κύτταρο ένα μεγάλο αριθμό λιποφιλικών ουσιών που συμπεριλαμβάνουν πολλά φάρμακα και φθορίζουσες χρωστικές ουσίες όπως η Rhodamine 123 (Rhod - 123) (Riordan, 1985). Πριν την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων, είναι σημαντική η διερεύνηση των πιθανών μηχανισμών αντοχής του κυττάρου -στόχου, στους οποίους μπορεί να συμπεριλαμβάνεται μεταξύ άλλων και η αυξημένη εκροή ή μειωμένη εισροή του φαρμάκου. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η σύγκριση 10 διαφορετικών στελεχών Leishmania (2 L. donovani και 8 L. infantum) με σκοπό τον εντοπισμό διαφορών ως προς τα βιολογικά και δομικά χαρακτηριστικά τους σε σχέση με την αντοχή τους στα φάρμακα. Η απομόνωση των στελεχών έγινε στο εργαστήριο Κλινικής Βακτηριολογίας, Παρασιτολογίας, Ζωονόσων και Γεωγραφικής Ιατρικής, του Τμήματος Ιατρικής, του Πανεπιστημίου Κρήτης, από ασθενείς και σκυλιά από την Κύπρο. Τα στελέχη αυτά είχαν χαρακτηριστεί ως «ανθεκτικά: 5» και «ευαίσθητα: 5» (1 L. donovani και 4 L. infantum σε κάθε κατηγορία), σύμφωνα με το ρυθμό εκροής της χρωστικής Rhod - 123 από την προμαστιγωτή μορφή του κάθε στελέχους, κατά την διάρκεια προκαταρκτικής μελέτης με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής. Στα 10 στελέχη μελετήθηκαν: α) βιολογικά χαρακτηριστικά: η πολλαπλασιαστική και η μολυσματική ικανότητα των προμαστιγωτών μορφών του παράσιτου (το μολυσματικό στάδιο για τον άνθρωπο/σκύλο) καθώς και ο χρόνος που χρειάζονται οι προμαστιγωτές μορφές για να μετατραπούν σε αξενικές αμαστιγωτές (η μετατροπή της προμαστιγωτής μορφής σε αμαστιγωτή πραγματοποιείται ενδοκυττάρια στο σώμα του θηλαστικού-ξενιστή) και αντίστροφα, ο χρόνος που χρειάζονται οι αξενικές αμαστιγωτές μορφές για να μετατραπούν σε προμαστιγωτές, β) η αντοχή τους σε 3 από τα φαρμακευτικά σκευάσματα (Glucantime, Amphotericin B και Miltefosine) που χρησιμοποιούνται για την θεραπεία της νόσου και γ) δομικά χαρακτηριστικά: σύγκριση του πρωτεϊνικού προφίλ των 10 στελεχών και αναζήτηση σε αυτά της αντλίας εκροής Pgp - 170 με τη μέθοδο του Western Blotting (WB). Τα βιολογικά χαρακτηριστικά που επελέγησαν να μελετηθούν, ενδεχομένως να σχετίζονται με την επιθετικότητα και την μολυσματική ικανότητα του κάθε στελέχους και στόχος της μελέτης ήταν να δημιουργηθεί το προφίλ του κάθε στελέχους σαν παθογόνου παράγοντα (επιθετικότητα - μολυσματικότητα -αντοχή στα φάρμακα) και να διερευνηθεί η σχέση των παραγόντων αυτών με τα δομικά χαρακτηριστικά τους καθώς και με την κλινική εικόνα του ασθενή/σκύλου από τον οποίο απομονώθηκε το παράσιτο και την γεωγραφική του κατανομή. Συγκρίνοντας το προφίλ των 10 στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη, προέκυψε ότι τα 2 στελέχη L. donovani, που απομονώθηκαν από ασθενείς, είχαν χαμηλότερη πολλαπλασιαστική ικανότητα από τα 8 στελέχη L. infantum που απομονώθηκαν από σκυλιά, και χρειάστηκαν μεγαλύτερο χρονικό διάστημα προκειμένου οι προμαστιγωτές τους μορφές να μετατραπούν σε αξενικές αμαστιγωτές και αντίστροφα. Η μολυσματική ικανότητα ήταν όμοια μεταξύ των 2 στελεχών L. donovani αλλά παρουσίαζε μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των 8 στελεχών L. infantum. Κατά τη μελέτη της αντοχής των στελεχών στα φάρμακα έγινε σύγκριση του ρυθμού μεταβολής του πληθυσμού των 10 υπό μελέτη στελεχών σε διάφορες συγκεντρώσεις των 3 φαρμάκων σε διάφορα χρονικά διαστήματα. Το Glucantime, ένα φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε εκτεταμένα σαν φάρμακο 1 ης γραμμής έναντι της λεϊσμανίασης, απεδείχθη μη αποτελεσματικό στη μείωση του πληθυσμού των προμαστιγωτών μορφών, in vitro. Αντίθετα, με την μεμονωμένη χορήγηση των παραγώγων του Glucantime, και κυρίως του SbV, τα αποτελέσματα ήταν πιο ενθαρρυντικά. Με τη χρήση της λιποσωμικής Αμφοτερικίνης Β, που έχει αντικαταστήσει το Glucantime σαν φάρμακο 1 ης γραμμής σε πολλές περιοχές, τα στελέχη παρουσίασαν αντοχή σε μικρότερο βαθμό, ενώ με την χρήση του νέου φαρμάκου Miltefosine δεν παρατηρήθηκε σημαντική αντοχή σε κανένα από τα 10 στελέχη. Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η πρωτεωμική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν 2 «ευαίσθητα» (H1, D2) και 2 «ανθεκτικά» (H2, D3) στελέχη. Το «ανθεκτικό» στέλεχος Η2 (L donovani) ήταν το μόνο στο οποίο ανιχνεύτηκε η πρωτείνη Heat Shock Protein 70 kDa (HSP 70) πλήρους μεγέθους. Στο «ανθεκτικό» στέλεχος D3 (L. infantum) ανιχνεύτηκαν 2 πρόδρομες μιτοχονδριακές και συγγενικές με την HSP 70 πρωτείνες αλλά και μια μη χαρακτηρίσιμη πρωτείνη. Και στα 4 στελέχη που μελετήθηκαν με την πρωτεωμική ανάλυση ανιχνεύθηκαν 2 επιπλέον πρωτείνες, οι οποίες υπερεκφράζονταν στα «ανθεκτικά» αλλά δεν ταυτοποιήθηκαν. Με την ανάλυση του WB ανιχνεύθηκε η Pgp - 170 και στα 5 «ανθεκτικά» (H2, D3, D4, D5, D8) στελέχη, με μεγαλύτερη έκφραση στα στελέχη L. infantum (D3, D4, D5, D8). Συνεπώς: α) η χρήση της φθορίζουσας χρωστικής CFSE και της κυτταρομετρίας ροής, για τον προσδιορισμό της πολλαπλασιαστικής ικανότητας των στελεχών συνιστούν μια γρήγορη, ευαίσθητη και σχετικά χαμηλού κόστους μέθοδο για την σύγκριση μεταξύ στελεχών, β) η πολλαπλασιαστική ικανότητα ήταν διαφορετική μεταξύ των στελεχών L. donovani και L. infantum, γ) η μολυσματική ικανότητα ήταν όμοια μεταξύ των στελεχών L. donovani αλλά παρουσίαζε μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των στελεχών L. infantum καθώς ήταν και ανεξάρτητη από την πολλαπλασιαστική ικανότητα, δ) τα στελέχη L. donovani χρειάστηκαν μεγαλύτερο χρονικό διάστημα για την μετατροπή τους από προμαστιγωτά σε αξενικά αμαστιγωτά, και αντίστροφα, σε σχέση με τα στελέχη L. infantum, και τα "ανθεκτικά" στελέχη χρειάστηκαν μεγαλύτερο χρονικό διάστημα για την μετατροπή τους από προμαστιγωτά σε αξενικά αμαστιγωτά, και αντίστροφα, σε σχέση με τα "ευαίσθητα" στελέχη, ε) λόγω ανάπτυξης αντοχής (MDR) του παράσιτου στο Glucantime, το φάρμακο αυτό δεν μπορεί πλέον να χρησιμοποιείται σαν θεραπεία 1ης γραμμής σε πολλές περιοχές, στ) η Αμφοτερικίνη Β παρουσίασε κάποιο βαθμό αντοχής, in vitro, στο 70% των στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν, ζ) το Miltefosine είναι πολύ αποτελεσματικό στην θεραπεία της λεϊσμανίασης. Όμως, σε περίπτωση χρήσης του για την θεραπεία των σκυλιών με λεϊσμανίαση σε περιοχές που αυτά θεωρούνται οι κύριοι ξενιστές παρακαταθήκη για το παράσιτο, υπάρχει περίπτωση σύντομα να αποκτηθεί αντοχή και στο φάρμακο αυτό, με αποτέλεσμα να μην μπορεί να χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την θεραπεία της νόσου στον άνθρωπο, η) με την ανίχνευση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την αντοχή του παράσιτου στα φάρμακα, Pgp - 170 στα στελέχη H2, D3, D4, D5, D8 και HSP 70 στα στελέχη H2, D3 (5 στελέχη τα οποία είχαν χαρακτηριστεί με την κυτταρομετρία ροής σαν «ανθεκτικά») επιβεβαιώνεται ότι η κυτταρομετρία ροής μπορεί να δώσει αξιόπιστα αποτελέσματα ως προς το βαθμό αντοχής του στελέχους, θ) η κυτταρομετρία ροής έχει το πλεονέκτημα να ανιχνεύει την Pgp σε ένα σχετικά μικρό αριθμό παράσιτων (<100,000) σε σχέση με το WB για το οποίο χρειάζεται συλλογή πρωτεϊνών από μεγαλύτερο αριθμό, περισσότερος χρόνος και πολύπλοκη διαδικασία. Tα παραπάνω δεδομένα επισημαίνουν την προσπάθεια κατανόησης των παραγόντων (το slope που προέκυψε από την παρακολούθηση της εκροής της Rhod - 123, το MDR, τη Pgp - 170, την HSP 70 και τη μετατροπή των στελεχών μεταξύ των 2 μορφών - προμαστιγωτά και αξενικά αμαστιγωτά - ) που σχετίζονται με την αντοχή του παράσιτου Leishmania στα φάρμακα, η γνώση των οποίων θα βοηθήσει στον προγραμματισμό της θεραπείας καθώς και στην παρακολούθηση του ασθενούς για την αποφυγή της αναζωπύρωσης της νόσου.
Φυσική περιγραφή 278 σ : πιν. ; 25 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Donovani
Flow cytometry
Fluorescent vital stain CFSE
IC50
Leismania infantum
Parasitology
Proteomics
Study of Leismania drug resistant phenomenon
Western blotting
Ανοσοαποτύπωση
Κυτταρομετρία ροής
Μελέτη αντοχής της Leismania στα φάρμακα
Φθορίζουσα χρωστική CFSE
Χρόνος ημισειας ζωής (IC50)Πρωτεωμική ανάλυση
Ημερομηνία έκδοσης 2010-07-20
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 94

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 26