| Περίληψη |
Mύκητες της υποκλάσης των Ασκομυκητων, έχουν την ικανότητα να προκαλούν ασθένειες σε διάφορα είδη φυτών. Η εφευρεση νεων εργαλείων μοριακής γενετικής ανάλυσης αποτελει αναγκη για την διερεύνηση των μηχανισμών πρόκλησης των ασθενειών από τους εν λόγω μύκητες και την καταπολεμηση τους.
Η γονιδιακή σίγηση, ως ενα σύγχρονο εργαλείο γενετικής ανάλυσης που επιτρέπει τη στοχευμένη καταστολή της έκφρασης γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, έχει δώσει νεες προοπτικες στη γενετική ανάλυση των ευκαρυωτων γενικά και ηδη χρησιμοποιείται ευρέως για τη διαλεύκανση της αλληλεπίδρασης φυτοπαθογονων μυκητων με φυτα-μοντελα.
Η παρουσα διατριβη αφορά στην επαγωγη της σίγησης στο υτοπαθογόνο ασκομύκητα Colletotrichum higginsianum. Για το σκοπό αυτό, επελέχθη το γονίδιο sgfp που κωδικεύει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη (GFP) σαν γονιδιο στόχευσης/αναφοράς. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε συνίστατο στο σχεδιασμο και την κατασκευη καταλληλων σιγητικών κασσετών οι οποίες φέρουν τμήμα του γονιδίου sgfp υπο τον έλεγχο ευκαρυωτικού υποκινητή και την ενσωμάτωσή τους σε πλασμιδιακους φορεις ικανούς να εισαχθουν στο μυκητα και να επαγουν γονιδιακη σιγηση, και ακομα στην εισαγωγη μιας αντικωδικής κασέτας (antisensegfp, AS-gfp-cas), σε στέλεχος του μυκητα το οποιο ήδη εξεφραζε το γονιδιο sgfp, καθώς για την κατάδειξη της μετα-μεταγραφικης σιγησης του γονιδιου στο στέλεχος-δέκτη.
Η κατασκευη των πλασμιδιων με σιγητικές κασσέτες PminiGPDA-AS-gfp-nosT και
PminiGPDA-S/AS-gfp-nosT -hairpin) περιελαμβανε την κλωνοποιηση τμήματος του γονιδίου sgfp σε καταλληλους πλασμιδιακούς φορείς υπό ευκαρυωτικό υποκινητη (PminiGPDA) και τερματιστη (nosT) της μεταγραφής και τη μεταφορά τους σε δυαδικo φορέα αγροβακτηρίου (pBIG4) που έφεραν ως γονίδια επιλογής τα bar και nptΙI (για αντοχή στo ζιζανιοκτονο BASTA και στο αντιβιoτικό γενετισινη, αντίστοιχα) , υπο τον ελεγχο του υποκινητη που PminiGPDA.
Μια σιγητική κασσέτα (AS-gfp-cas) είσηχθη σε στέλεχος του μύκητα που ήδη εξέφραζε συστατικά τη φθορίζουσα πρωτεϊνη, με συνεπώαση σπορίων ενός σταθερού sGfp+ στελέχους του με καλλιέργεια Αγροβακτηριου (στέλεχος AGLI) στο οποίο ειχε προηγουμενως εισαχθεί το δυαδικό πλασμιδιο/φορέας (pBIG-AS-gfpcas).
Φαινοτυπικός έλεγχος των υφών του μετασχηματισμενου μυκητα μετά από διαδοχικές επανακαλλιέργειες θαλλών του μύκητα σε θρεπτικό μέσο επιλογής με αυξανόμενες συγκεντρώσεις BASTA έδειξε ότι σε ένα αριθμό θαλλών και σε αρχικά στάδια της επιλογής ένα ποσοστό των υφών του μήκητα ειχε μειωμένα ή μηδενικά επίπεδα φθορισμου στο υπεριωδες φως (UV), σε σχεση με το μητρικο στελεχος-
δέκτη. Έγιναν προσπάθειες αυξησης του βαθμού σίγησης με επανακαλιέργειες θαλλών σε αυξημένες συγκέντρωσεις του ΒΑSΤΑ και με απομόνωση μονοσπορων θαλλών από θετικούς ως προς τη σίγηση θαλλους, και επίσης προσδιοριστηκαν τα επιπέδα του gfp-mRNA σε επιλεγμενους θαλλους του μύκητα.
|
Μετα-μεταγραφική γονιδιακή σίγηση σε φυτοπαθογόνο μύκητα
