| Περίληψη |
Οι μη γραμμικές τεχνικές απεικόνισης αντιπροσωπεύουν την πρώτη γραμμή έρευνας στην κυτταρική βιολογία. Οι τεχνικές αυτές αποτελούν ένα ισχυρό εργαλείο για την αποσαφήνιση δομικών και ανατομικών μεταβολών σε βιολογικά δείγματα, καθώς και στην παρακολούθηση λειτουργιών και αναπτυξιακών διαδικασιών in vivo σε μικροσκοπική κλίμακα. Η in vivo διερεύνηση κυτταρικών και υποκυτταρικών δραστηριοτήτων, μέσω μη γραμμικών τεχνικών απεικόνισης, μπορεί να παράσχει νέες πληροφορίες όσον αφορά θεμελιώδη βιολογικά ζητήματα, οδηγώντας την ίδια στιγμή στην ανάπτυξη καινοτόμων μεθοδολογιών, χρήσιμων σε ένα εύρος εφαρμογών στο πεδίο της Βιολογίας και της Ιατρικής.
Μέσα στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, επιτεύχθηκε η ανάπτυξη και η βελτιστοποίηση ενός συμπαγούς, φιλικού προς το χρήστη, πρότυπου μικροσκοπίου, το οποίο συνδυάζει διαφορετικές μη γραμμικές τεχνικές απεικόνισης όπως τον πολυφωτονικά διεγειρόμενο φθορισμό και την παραγωγή οπτικών αρμονικών συχνοτήτων (μια αναλυτική επισκόπηση των οποίων δίνεται στα δύο πρώτα κεφάλαια) μαζί με τη δυνατότητα πραγματοποίησης πειραμάτων νανοχειρουργικής. Η πειραματική συσκευή που αναπτύχτηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκε σε μια πληθώρα βιολογικών εφαρμογών, παρέχοντας καινοτόμες πληροφορίες.
Κατ’ αρχάς, καταδείξαμε το σημαντικό δυναμικό της μικροσκοπίας τρίτης αρμονικής στο χαρακτηρισμό των διαφορετικών σταδίων εμβρυογένεσης του οργανισμού μοντέλου C. Elegans. Επιπροσθέτως, πραγματοποιήθηκαν μελέτες παρακολούθησης των κυττάρων σε ζωντανά, μη σημασμένα έμβρυα μέσω της δυναμικής απεικόνισης (έως 7 ώρες) των μιτωτικών κυτταρικών διαιρέσεων κατά τη διάρκεια της πρώιμων σταδίων της εμβρυογένεσης. Έτσι, η μικροσκοπία τρίτης αρμονικής καταδείχτηκε ως ένα ισχυρό διαγνωστικό εργαλείο, το οποίο παρέχει χρήσιμες πληροφορίες και προσφέρει νέα στοιχεία αναφορικά με την πολύπλοκη αναπτυξιακή διαδικασία της εμβρυογένεσης του C. Elegans.
Τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα της προηγούμενης μελέτης αξιοποιήθηκαν περαιτέρω στην επόμενη ενότητα της παρούσας εργασίας, όπου κατέστη δυνατή η παρακολούθηση της σχηματομόρφωσης προεμφυτευτικών εμβρύων. Ειδικότερα, η απεικόνιση τρίτης αρμονικής, μέσω του εντοπισμού μιτοχονδρίων / λιπιδικών δομών, έχει τη δυνατότητα να προσφέρει αξιόπιστες πληροφορίες σχετικές με το ενεργειακό προφίλ προεμφυτευτικών εμβρύων, τη χρονική εξέλιξη διαφορετικών εμβρυονικών σταδίων, την πολικότητα του εμβρύου πριν τη μιτωτική διαίρεση καθώς και την ισοδυναμία των βλαστομεριδίων. Η ποσοτικοποίηση του σήματος τρίτης αρμονικής κατέδειξε υψηλότερο σήμα στα έμβρυα που βρισκόντουσαν στη φάση των δύο κυττάρων, ενώ υπολογίστηκε μια αντίστοιχη διαφορά σήματος 12-18% ανάμεσα σε βλαστομερίδια εμβρύων οκτώ κυττάρων. Μια τέτοια μεθοδολογία παρέχει νέες, μη επεμβατικές πρακτικές για την παρακολούθηση της ενδοκυτταρικής δομικής σχηματομόρφωσης, που σχετίζεται με το ενεργειακό προφίλ ενός αναπτυσσόμενου εμβρύου και που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην επιλογή του εμβρύου κατά τη διάρκεια των διαδικασιών εξωσωματικής γονιμοποίησης.
Είναι γνωστό πως τα λιπίδια αποτελούν τα κύρια συστατικά κυτταρικών μεμβρανών, λειτουργούν ως σηματοδοτικά μόρια και είναι η κύρια εναπόθεση ενέργειας των οργανισμών. Η περίσσεια ενέργειας αποθηκεύεται ως λίπος στα λιποκύτταρα, οδηγώντας σε παχυσαρκία. Ο ενεργειακός έλεγχος και τα μεταβολικά μονοπάτια που ελέγχουν το μεταβολισμό των λιπιδίων είναι ακόμα μη αποσαφηνισμένα. Για το σκοπό αυτό, αναπτύξαμε μια εναλλακτική ως προς τις συνήθεις προσεγγίσεις, μέσω χρωστικών ουσιών, μεθοδολογία, η οποία συνδέεται με τη μη γραμμική μικροσκοπία τρίτης αρμονικής και στοχεύει στην απεικόνιση των λιπιδικών εναποθέσεων χρησιμοποιώντας το C. Elegans ως οργανισμό μοντέλο. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η προσέγγιση αυτή είναι μη καταστρεπτική και δεν απαιτεί τη χρώση του βιολογικού δείγματος. Αποκλείσαμε την πιθανότητα της συνεισφοράς σήματος τρίτης αρμονικής από τη λιποφουσκίνη και αντ’ αυτού βρήκαμε πως το λίπος είναι αυτό που συνεισφέρει κυρίως στα υψηλά σήματα τρίτης αρμονικής στην περιοχή του εντέρου του C. Elegans. Για να επαληθεύσουμε την προσέγγισή μας, δείξαμε πως ο πολυφωτονικά διεγειρόμενος φθορισμός, έπειτα από τη σήμανση λιπιδίων με BodiPy 500/510, Nile Red και Oil Red-O και τα σήματα τρίτης αρμονικής, συνεντοπίζονταν σε σκώληκες αγρίου τύπου. Για την περαιτέρω στήριξη της ικανότητας της τρίτης αρμονικής όσον αφορά τον εντοπισμό λιπιδικών σταγόνων, δείξαμε πως οι μεταλλαγμένοι σκώληκες με ελλιπή τα FAT-7 και τα GLO-1 γονίδια, είχαν λιγότερες λιπιδικές σταγόνες, ενώ οι αντίστοιχοι DAF-2 είχαν περισσότερες σε σχέση με τους σκώληκες αγρίου τύπου. Τέλος, η μελέτη μας έδειξε πως το λίπος συσσωρεύονταν σταδιακά έως την πρώιμη ενηλικίωση, ενώ μειώνονταν σταδιακά κατά τη διάρκεια των μεταγενέστερων σταδίων της ζωής του σκώληκα. Συνεπώς, μέσα στα πλαίσια της μελέτης αυτής, η απεικόνιση μέσω τρίτης αρμονικής καταδείχτηκε ως ένα δυνητικό καινοτόμο εργαλείο για την παρακολούθηση σημαντικών βιολογικών διεργασιών που σχετίζονται με τη διαδικασία της γήρανσης.
Στην τελευταία ενότητα της παρούσας διατριβής, αξιοποιήσαμε τη μικροσκοπία τρίτης αρμονικής ως ένα ισχυρό διαγνωστικό εργαλείο για την ταυτοποίηση δομών οι οποίες υπόκεινται σε νανοχειρουργικά πειράματα. Η νανοχειρουργική μέσω χρήσης λέιζερ τα οποία εκπέμπουν παλμούς με χρονική διάρκεια της τάξης των femtosecond (10-15 s), αποτελεί μια σχετικά καινούρια τεχνική που επιτρέπει την επιλεκτική αποδόμηση υποκυτταρικών δομών, χωρίς να προκαλείται κάποια ανεπιθύμητη καταστροφή στις παρακείμενες περιοχές. Οι στοχευόμενες δομές συχνά σημαίνονται με κάποια συγκεκριμένη χρωστική ουσία, έτσι ώστε να απεικονιστούν με ευκρίνεια κατά τη διάρκεια της νανοχειρουργικής επέμβασης. Ωστόσο, η εξακρίβωση του τελικού νανοχειρουργικού αποτελέσματος καθίσταται αρκετά δύσκολη, εφόσον οι στοχευόμενες δομές θα μπορούσαν να έχουν απλά υποστεί φωτολεύκανση και όχι να έχουν επιλεκτικά αποδομηθεί. Από την άλλη πλευρά, στην περίπτωση της απεικόνισης μέσω τρίτης αρμονικής, δεν απαιτείται σήμανση του βιολογικού δείγματος, εφόσον το φαινόμενο της παραγωγής οπτικών αρμονικών συχνοτήτων αποτελεί μια εγγενή ιδιότητα της ύλης. Χρησιμοποιώντας ένα σύνθετο σύστημα το οποίο ενσωματώνει μη γραμμικές τεχνικές απεικόνισης με τη δυνατότητα πραγματοποίησης νανοχειρουργικών επεμβάσεων, κατέστη δυνατή η επιλεκτική αποδόμηση υποκυτταρικών δομών (κυρίως λιπιδίων) σε κύτταρα HeLa, επιβεβαιώνοντας με τον τρόπο αυτό την αξιοπιστία της απεικόνισης μέσω της τρίτης αρμονικής. Κατά τη διάρκεια του τελευταίου μέρους της μελέτης εξακριβώθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά το πέρας της νανοχειρουργικής διαδικασίας, μέσω μετρήσεων διφωτονικά διεγειρόμενου φθορισμού.
Συμπερασματικά θα λέγαμε ότι στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αποδείχτηκε πως οι τεχνικές μη γραμμικής μικροσκοπίας παρουσιάζουν μια μεγάλη δυναμική, όχι μόνο στη βασική βιοϊατρική έρευνα, αλλά και σε πραγματικά προβλήματα. Επιπροσθέτως, αυτή η δυνατότητα εφαρμογής έχει ήδη επεκταθεί στη διάγνωση και θεραπεία διαφόρων σημαντικών διαταραχών, όπως των νευροεκφυλιστικών και αρτηριακών παθήσεων και του καρκίνου.
|
Nonlinear optical procedures for the diagnostics and processing of biological samples by using ultra-short laser pulses
