| Περίληψη |
Ο καρκίνος του παχέος εντέρου θεωρείται από τα συχνότερα νεοπλάσµατα στον άνθρωπο. Περίπου 1.000.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου παχέος-ορθού εµφανίζονται, παγκοσµίως, κάθε χρόνο, ενώ περίπου 500.000 άνθρωποι καταλήγουν, ετησίως, λόγω της συγκεκριµένης κακοήθειας. Φυλετικές και εθνολογικές διαφορές καθώς και περιβαλλοντικές επιδράσεις σχετίζονται µε διαφορές στην επίπτωση του νεοπλάσµατος. Ο καρκίνος παχέος–ορθού είναι το επιφαινόµενο µίας πολυσταδιακής διεργασίας. Η απενεργοποίηση του γονιδίου APC (Adenomatous Polyposis Coli), διαταραχές της µεθυλίωσης του DNA, η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων RAS, η απώλεια του γονιδίου DCC (deleted in colon cancer), η αδρανοποίηση µέσω απάλειψης του p53, ο ρόλος των µεταλλακτικών γονιδίων MMR, αλλά και επιπρόσθετες µεταλλάξεις, είναι βήµατα που επάγουν την καρκινογένεση και συνεισφέρουν στην κακοήθη συµπεριφορά. Η οικογένεια των RAS γονιδίων (KRAS, NRAS, HRAS), στα φυσιολογικά κύτταρα, έχουν πολλαπλές λειτουργίες ρυθµίζοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση. Ο καταρράκτης Ras/Raf/MEK/MAPK πρωτεϊνικών κινασών, µέσω µηχανισµού φωσφορυλίωσης, καταλύει την επαγωγή µιτωγόνων σηµάτων στον πυρήνα του κυττάρου, µε αποτέλεσµα τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Σηµειακές µεταλλάξεις του γονιδίου KRAS στο κωδικόνιο 12 σχετίζονται ισχυρά µε την ογκογόνο ενεργοποίηση του. Η οµάδα RAF γονιδίων περιλαµβάνει τρία πρωτο-ογκογονίδια, το ARAF1, το RAF1 και το BRAF. Το BRAF γονίδιο ανευρίσκεται στη χρωµοσωµική θέση 7q34 και είναι λειτουργικό γονίδιο. Η πρωτεΐνη, που κωδικοποιεί ανήκει στην κατηγορία πρωτεϊνών σερίνης-θρεονίνης κινάσης και ενεργοποιείται από το σύνδεσµο GTP – Ras. Εµπλέκεται στη µεταγωγή µιτωγόνων σηµάτων από την κυτταροπλασµατική µεµβράνη στον πυρήνα. Σηµειακές µεταλλάξεις µε ανεπαρκή επιδιόρθωση, µάλλον, βρίσκονται πίσω από την ογκογόνο ενεργοποίηση του. Εµπλέκεται στον κυτταρικό κύκλο ενώ φαίνεται να έχει και αντι-αποπτωτική δράση. Το BRAF, ίσως, είναι προτιµητέος στόχος µετάλλαξης αφού κωδικοποιεί πρωτεΐνη που χαρακτηρίζεται από υψηλότερη βασική δραστηριότητα κινάσης σε σχέση µε το RAF1. Η πλέον συνήθης µετάλλαξη του BRAF, στον καρκίνο παχέος-ορθού, είναι η V600E (εξώνιο 15) που χαρακτηρίζεται από αντικατάσταση βαλίνης µε γλουταµικό οξύ, στη θέση 600 (προηγουµένως βιβλιογραφικά αναφερόµενη σαν V599E), της πρωτεϊνικής µορφής που κωδικοποιεί και φαίνεται να συναντάται πάνω από το 50% των µεταλλάξεων που παρατηρήθηκαν ενώ σε καµία περίπτωση δε συσχετίστηκε µε συνύπαρξη µεταλλάξεων KRAS. Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η διερεύνηση της συνεισφοράς των ογκογονικών µεταλλάξεων του BRAF στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου, της δυνητικής τους σχέση µε µεταλλάξεις του KRAS στον ίδιο πληθυσµό καρκινικών δειγµάτων καθώς και η ανάδειξη πιθανών συσχετίσεων µε τα κλινικά και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων που εξετάστηκαν. Στα πλαίσια αυτής της µελέτης πραγµατοποιήθηκε απ’ ευθείας ανίχνευση της ακολουθίας βάσεων του εξωνίου 15 του γονιδίου BRAF σε 61 δείγµατα σποραδικών όγκων παχέος-ορθού, χειρουργικώς εξαιρεθέντων. Κάθε δείγµα εξετάστηκε παθολογοανατοµικά για την επιβεβαίωση της ιστολογίας του (αδενοκαρκινώµατα). Καταγράφησαν ατοµικό και οικογενειακό ιστορικό των ασθενών, δηµογραφικά και κλινικά στοιχεία. Μείζον κριτήριο αποτέλεσε η σποραδικότητα των όγκων. Για την ανίχνευση σηµειακών µεταλλάξεων στο γονίδιο BRAF και KRAS ενισχύθηκαν οι περιοχές του εξωνίου 15 και του κωδικονίου 12 αντίστοιχα µε την τεχνική της PCR µέσω της χρήσης κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Άµεσος έλεγχος της
ακολουθίας των αλληλουχιών του εξωνίου 15 του BRAF πραγµατοποιήθηκε σε όλα τα δείγµατα µε αυτόµατο αναλυτή, σε κέντρο του εξωτερικού [BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer] ενώ για την ανίχνευση σηµειακών µεταλλάξεων του κωδικονίου 12 στο γονίδιο KRAS ακολουθήθηκε κατά κύριο λόγο ανάλυση πολυµορφισµού µεγέθους περιοριστικών θραυσµάτων (RFLP) µε τη χρήση περιοριστικής ενδονουκλεάσης MvaI (Roche Diagnostics GmbH, Germany). DNA από την καρκινική κυτταρική σειρά SW480 φέρουσα την οµόζυγη µετάλλαξη στο κωδικόνιο 12 του KRAS χρησιµοποιήθηκε ως θετικό σηµείο αναφοράς και ελέγχου. Ακολούθησε τυχαιοποιηµένος έλεγχος επιβεβαίωσης KRAS θετικών δειγµάτων µε άµεσο έλεγχο της ακολουθίας βάσεων του κωδικονίου 12. Βρέθηκε ότι η ακολουθία του εξωνίου 15 σε όλα τα δείγµατα ήταν υψηλά διατηρηθείσα ως προς το φυσιολογικό. Δεν ταυτοποιήθηκε καµία νουκλεοτιδική µεταβολή ή απόκλιση που θα µπορούσε να επιφέρει τροποποιήσεις στην αλληλουχία αµινοξέων σε επίπεδο BRAF πρωτεΐνης. Η τεχνική ανάλυση για την ανίχνευση KRAS µεταλλάξεων, στο κωδικόνιο 12 ήταν εφικτή σε 58 δείγµατα. Δεκαεπτά από τα 58 δείγµατα έφεραν τις εν λόγω µεταλλάξεις. Όλες οι KRAS µεταλλάξεις ήταν ετερόζυγες. Από τους 17 όγκους φέροντες τις KRAS µεταλλάξεις 12 (34.3%) προέρχονταν από άνδρες (από 35 που εξετάστηκαν συνολικά) και 5 (21.7%) από γυναίκες (από 23 που εξετάστηκαν συνολικά). Ασθενείς µε ηλικία 70 έτη ή νεότεροι έφεραν KRAS µεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12, συχνότερα από ότι οι ασθενείς ηλικίας άνω των 70 ετών (P= 0.028, Pearson chi square test). Επίσης ασθενείς ηλικίας µεταξύ 61 και 70 ετών ήταν πιο πιθανό να ‘φέρουν’ τις εν λόγω µεταλλάξεις σε σχέση µε άλλες ηλικιακές οµάδες (≤60 έτη ή >70 έτη), (P= 0.040, Pearson chi square test). Το 38.1% των όγκων µε εντόπιση στο τυφλό, ανιόν και εγκάρσιο ενώ το 24.3% των όγκων µε εντόπιση στο κατιόν κόλον και ορθό έφεραν µεταλλάξεις αντιστοίχως. Καρκινώµατα σε Dukes’Α στάδιο και Dukes’Β στάδιο έφεραν KRAS µεταλλάξεις σε ποσοστό 20.0% και 28.6% αντιστοίχως ενώ όγκοι σε Dukes’ C στάδιο και Dukes’ D στάδιο είχαν τις εν λόγω µεταλλάξεις σε ποσοστό 34.6% και 27.3% αντίστοιχα. Σε δύο µόνο περιπτώσεις δεν υπήρχαν επαρκή στοιχεία για το στάδιο κατά Dukes. Η περιγραφική προσέγγιση αυτών των αποτελεσµάτων αναδεικνύει ότι όγκοι σε στάδιο Dukes’ C και Dukes’ D έφεραν τις περισσότερες µεταλλάξεις (περίπου 60%). Από 43 καλά και µέτρια διαφοροποιηµένους όγκους το 27.9% έφερε KRAS µεταλλάξεις ενώ από 8 φτωχά διαφοροποιηµένους όγκους το 37.5% έφερε τις εν λόγω µεταλλάξεις (στοιχεία διαθέσιµα για 51 δείγµατα όγκων). Τέλος KRAS µεταλλάξεις βρέθηκαν στο 25.6% των µη βλεννοπαραγωγών όγκων που εξετάστηκαν και στο 40% των βλεννοπαραγωγών όγκων (στοιχεία διαθέσιµα για 44 δείγµατα όγκων). Η µη ανεύρεση BRAF µεταλλάξεων είναι, ίσως, προϊόν περιβαλλοντικών, εθνολογικών διαφορών ή και άλλων µοριακών φαινοµένων. Η αυτοµατοποιηµένη ανίχνευση της ακολουθίας βάσεων του εξωνίου 15 και τα αποτελέσµατα αυτής αποµακρύνουν ισχυρά την πιθανότητα παρεκκλίσεων λόγω µεθοδολογίας. Από την άλλη πλευρά, διάφορες βιβλιογραφικές αναφορές παρουσιάζουν συχνότητες BRAF µεταλλάξεων µε µεγάλο εύρος διακύµανσης (5% -20%) από σειρά σε σειρά, γεγονός που έµµεσα µπορεί να υποτεθεί ότι σχετίζεται, τουλάχιστον µερικώς, µε πληθυσµιακές διαφορές λόγω περιβαλλοντικών, εθνολογικών ή και φυλετικών παραγόντων. Οι KRAS µεταλλάξεις φαίνεται να παραµένουν οι «συνήθεις ύποπτοι» αφού η συχνότητα µε την οποία ανευρίσκονται, στην παρούσα µελέτη, είναι περίπου 30%, εύρηµα συµβατό µε τη διεθνή βιβλιογραφία.
|
Μελέτη του ρόλου των γονιδίων RAF και RAS στα κακοήθη νεοπλάσματα του παχέος εντέρου
