| Περίληψη |
Η Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (Χ.Α.Π.) αποτελεί μια από τις σημαντικότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Όπως έχει διαπιστωθεί μέχρι τώρα από πολλές μελέτες, το κάπνισμα του τσιγάρου αντιπροσωπεύει τον κυριότερο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της Χ.Α.Π. Φαίνεται όμως ότι υπάρχει αξιοσημείωτη ατομική διαφοροποίηση όσον αφορά την απάντηση στην έκθεση του καπνού του τσιγάρου, αφού τελικά λιγότερο από 20% των καπνιστών αναπτύσουν Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια. Αυτό υποδεικνύει ότι επιπλέον γενετικοί και περιβαλλοντολογικοί παράγοντες φαίνεται να ευθύνονται για την ανάπτυξη της νόσου. Αν και μέχρι τώρα πολλές κλινικές μελέτες σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της Χ.Α.Π., εντούτοις ελάχιστα γνωρίζουμε για την μοριακή βάση της ασθένειας. Το Μικροδορυφορικό DNA αποτελείται από βραχείες διαδοχικά επαναλαμβανόμενες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες και βρίσκεται διασκορπισμένο σε όλο το γονιδίωμα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, ενώ υπάρχει σε περισσότερες από 100.000 διαφορετικές θέσεις σε όλα τα χρωμοσώματα του ανθρώπου. Το φαινόμενο της Αστάθειας τoυ Μικροδορυφορικού DNA (MICROSATELLITE INSTABILITY, MI) έχει συνδεθεί με υψηλή συχνότητα μεταλλάξεων και αποτελεί κοινό εύρημα στους περισσότερους καρκίνους. Στην περίπτωση της Χρόνιας Αποφρακτικής Πνευμονοπάθειας, από τις μέχρι σήμερα γνωστές βιβλιογραφικές αναφορές, δεν έχει επιχειρηθεί η ανίχνευση του φαινομένου της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA. Το Πρώτο Πρωτόκολλο της μελέτης μας, σκοπό είχε να διερευνήσει την πιθανότητα ανίχνευσης του φαινομένου της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA σε κυτταρολογικά δείγματα (πτύελα) ασθενών με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια και να εκτιμηθεί η περαιτέρω πιθανότητα διερεύνησης γενετικών διαταραχών στους ασθενείς με Χ.Α.Π., χρησιμοποιώντας σαν δείκτη Αστάθειας. Δείγματα (πτύελα και περιφερικό αίμα) από τριάντα-ένα (31) ασθενείς με Χ.Α.Π. αναλύθηκαν. Έξι δείκτες του Μικροδορυφορικού DNA (Microsatellite markers) χρησιμοποιήθηκαν, για τέσσερα διαφορετικά χρωμοσώματα Η Αστάθεια των την συχνότητα εμφάνισης του φαινομένου της μικροδορυφορικών αλληλουχιών, ανιχνεύθηκε συγκρίνοντας το ηλεκτροφορητικό μοντέλο των δεικτών του Μικροδορυφορικού DNA που ενισχύθηκαν με την μέθοδο της Αλυσιδωτής Αντίδρασης με Πολυμεράση (PCR), στα δυο διαφορετικά δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν από τον κάθε ασθενή, και τα οποία αντιστοιχούσαν στο DNA από το περιφερικό αίμα και στο DNA από το κυτταρολογικό δείγμα (πτύελα). Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA χαρακτηρίστηκε κάθε διαφορά στην κινητικότητα των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων, πάνω στην πηκτή του πολυακρυλαμιδίου κατά την ηλεκτροφόρηση, όπως ακόμα και η δημιουργία νέων αλληλομόρφων (novel alleles). Το DNA που εκχειλίστηκε από το περιφερικό αίμα θεωρήθηκε το φυσιολογικό πρότυπο για το γονιδιακό DNA, ενώ το DNA που προήλθε από τα πτύελα, ελέγχθηκε για την έκφραση του φαινομένου της αστάθειας των μικροδορυφορικών αλληλουχιών. Από τις τριάντα-ένα (31) περιπτώσεις που μελετήθηκαν επτά (7), δηλαδή ποσοστό 23% εμφάνισαν Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA. Στις πέντε (5), από τις επτά (7) θετικές περιπτώσεις, Αστάθεια ανιχνεύθηκε μόνο σε ένα μικροδορυφορικό δείκτη, ενώ στις υπόλοιπες δύο (2) θετικές περιπτώσεις η αστάθεια αφορούσε δύο μικροδορυφορικούς δείκτες. Για να διαπιστωθεί αν η εμφάνιση του φαινομένου της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA, αποτελεί και δείκτη βαρύτητας της νόσου, συγκρίθηκαν κλινικοί και εργαστηριακοί παράμετροι των ασθενών που εμφάνισαν το φαινόμενο με αυτούς που ήταν αρνητικοί, χωρίς όμως να παρατηρηθούν στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά την ηλικία, την καπνιστική συνήθεια, τα σπιρομετρικά ευρήματα ανάμεσα στις δύο υποομάδες. Έτσι θεωρήθηκε ότι το φαινόμενο της Αστάθειας αποτελεί ανιχνεύσιμη γενετική αλλοίωση σε κυτταρολογικά δείγματα ασθενών με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια και μπορεί να αντιπροσωπεύει δείκτη πιθανής κακοήθειας, ή δείκτη γενετικής διαταραχής που σχετίζεται με την εκδήλωση της νόσου. Όμως ο σχεδιασμός της προηγούμενης μελέτης δεν μας επέτρεψε να απαντήσουμε και να καταλήξουμε σε συμπεράσματα, αφού η παρακολούθηση των ασθενών δεν έγινε για μακρό χρονικό διάστημα και επιπλέον δεν έγινε σύγκριση με καπνιστές, χωρίς κλινικά ή σπιρομετρικά ευρήματα Χ.Α.Π. Έτσι, το Δεύτερο Πρωτόκολλο σχεδιάστηκε για να μελετηθεί η πιθανότητα ανίχνευσης του φαινόμενου της Αστάθειας των Μικροδορυφορικών Αλληλουχιών του DNA, σε καπνιστές με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (Καπνιστές με Χ.Α.Π.), και σε καπνιστές που δεν εμφάνιζαν κλινικά ή σπιρομετρικά ευρήματα της νόσου (Καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π.). Η Υπόθεση που τέθηκε, ήταν ότι αν το φαινόμενο της Αστάθειας, αποτελεί δείκτη δυνητικής κακοήθειας, τότε θα πρέπει να ανιχνεύεται και στους καπνιστές με Χ.Α.Π., αλλά και στους καπνιστές χωρίς εκδήλωση της νόσου. Από την άλλη πλευρά, αν το φαινόμενο της Αστάθειας αποτελεί γενετική ανωμαλία που οδηγεί στην ανάπτυξη της Χ.Α.Π., τότε θα πρέπει να ανιχνεύεται, κατά κύριο λόγο στους ασθενείς με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια, εξηγώντας κατά ένα μέρος την πολύπλοκη γενετική βάση της νόσου. Επτά υψηλά πολυμορφικοί μικροδορυφορικοί δείκτες χρησιμοποιήθηκαν για τα ίδια χρωμοσώματα που ερευνήθηκαν και στο πρώτο πρωτόκολλο ακολουθώντας την ίδια μέθοδο. Δείγματα (πτύελα και περιφερικό αίμα), από εξήντα (60) καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. και πενήντα εννέα (59) καπνιστές με σοβαρού βαθμού Χ.Α.Π. και παρόμοιο ιστορικό καπνίσματος 48 ±25 και 54 ± 33 (x ± SD) pack years (πακέτα επί έτη) αντίστοιχα, αναλύθηκαν. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε μία φορά για τους "μη-Χ.Α.Π. καπνιστές" και δύο φορές για τους "Χ.Α.Π.-καπνιστές", στην αρχή, και 24 μήνες αργότερα. Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA ανιχνεύθηκε σε 14 καπνιστές με Χ.Α.Π., δηλαδή σε ποσοστό 24%, ενώ αντίθετα κανένας από τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. δεν εμφάνισε το φαινόμενο. Στις 10 από τις 14 θετικές περιπτώσεις ένας μόνο μικροδορυφορικός DNA δείκτης εμφάνισε το φαινόμενο, ενώ στις υπόλοιπες 4 θετικές περιπτώσεις Αστάθεια εκδηλώθηκε, σε δύο διαφορετικούς μικροδορυφορικούς δείκτες. Προκειμένου να διερευνηθεί η σχέση του φαινομένου της Αστάθειας με την βαρύτητα της νόσου, συγκρίθηκαν κλινικοί και εργαστηριακοί παράμετροι των ασθενών που εμφάνισαν το φαινόμενο με αυτούς που ήταν αρνητικοί, χωρίς όμως να παρατηρηθούν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην ηλικία, στην επιβίωση, στα σπιρομετρικά ευρήματα, στην θεραπευτική αγωγή, στην καπνιστική συνήθεια και στη συχνότητα ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα, ανάμεσα στις δύο ομάδες. Συμπερασματικά, από την παρούσα μελέτη, αποδεικνύεται ότι το φαινόμενο της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA αποτελεί κοινό εύρημα αποκλειστικά στους καπνιστές με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια αφού ανεβρέθηκε σε ποσοστό 24% στα κυτταρολογικά τους δείγματα, ενώ αντίθετα κανένας καπνιστής χωρίς Χ.Α.Π. δεν εμφάνισε το φαινόμενο. Τα αποτελέσματα αυτά στηρίζουν την υπόθεση ότι η Αστάθεια των Μικροδορυφορικών αλληλουχιών του DNA μπορεί να σχετίζεται με την πολύπλοκη γενετική βάση της Χρόνιας Αποφρακτικής Πνευμονοπάθειας. Επιπλέον, η αστάθεια αυτή θα μπορούσε να αποτελέσει δείκτη γενετικής διαταραχής που σχετίζεται με το κάπνισμα του τσιγάρου και μπορεί να οδηγήσει περαιτέρω στην ανάπτυξη της Χ.Α.Π.
|
Μελέτη της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA (Microsatellite instability) σε κυτταρολογικά δείγματα ασθενών με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια
