| Περίληψη |
Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του μηχανισμού μεταγραφικής ενεργοποίησης από τους παράγοντες HNF-4 και HNF-1. Οι HNF-4 και HNF-1 είναι ηπατοειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν γονίδια που παίζουν ρόλο σε ποικίλα μεταβολικά μονοπάτια στο ενήλικο ήπαρ. Στον άνθρωπο ετερόζυγες μεταλλαγές στα γονίδια HNF-4 και HNF-1 έχουν συνδεθεί με την μορφή του νεανικού διαβήτη τύπου ΙΙ που ονομάζεται MODY (MODY Ι και ΙΙ αντίστοιχα), αποδεικνύοντας την σημασία των παραγόντων αυτών στη λειτουργία των β-κυττάρων του παγκρέατος. Η εργασία αυτή χωρίζεται σε τρία μέρη. Στο πρώτο μέρος μελετάται η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης του HNF-4 με τον συνενεργοποιητή CBP που έχει ενεργότητα ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών. Στη εργασία αυτή δείχθηκε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας HNF-4 ακετυλιώνεται από τον συνενεργοποιητή CBP σε αμινοξικά κατάλοιπα (λυσίνες) που εντοπίζονται στην περιοχή που είναι υπεύθυνη για την είσοδο του παράγοντα στον πυρήνα του κυττάρου (NLS).In vitro πειράματα και πειράματα παροδικής διαμόλυνσης έδειξαν ότι η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση αυξάνει την ικανότητα πρόσδεσης του HNF-4 στο DNA και την συγγένεια της αλληλεπίδρασης με τον ίδιο τον συνεργοποιητή CBP και είναι απαραίτητη για την μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4. Η πιο ενδιαφέρουσα παρατήρηση της εργασίας αυτής είναι ότι η ακετυλίωση του HNF-4 είναι πολύ σημαντική για την συγκράτηση του παράγοντα στον πυρήναα του κυττάρου. Από τα πειράματα είναι φανερό ότι όταν ο παράγοντας δεν είναι ακετυλιωμένος εξέρχεται από τον πυρήνα του κυττάρου στο κυτταρόπλασμα μέσω της πρωτεΐνης CRM1 που αλληλεπιδρά με μεγαλύτερη συγγένεια με την μη-ακετυλιωμένη μορφή του HNF-4. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίοας προτείνουν ότι η ακετυλίωση είναι μια σημαντική μετα-μεταφραστική τροποποίηση που επηρεάζει πολλές ιδιότητες του μεταγραφικού παράγοντα HNF-4, σημαντικές για την δράση του. Στο δεύτερο κομμάτι της εργασίας μελετάται ο μηχανισμός με τον οποίο ο παράγοντας HNF-1 ενεργοποιεί την μεταγραφή. Πιο συγκεκριμένα , βρέθηκε ότι ο HNF-1 αλληλεπιδρά in vivo και in vitro με τις ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών CBP, P/CAF, SRC-1 και RAC3 και ότι η συνεργιστική δράση των συνενεργοποιητών αυτών αυξάνει την HNF-1 εξαρτώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση. Πιο λεπτομερής μελέτη έδειξε ότι ο παράγοντας CBP προσδένεται στο αμινοτελικό άκρο του HNF-1 που αντιστοιχεί στην περιοχή με την οποία προσδένεται στο DNA, ενώ οι άλλοι τρεις στην καρβοξυτελική περιοχή που είναι υπεύθυνη για την ενεργοποιητική του δράση (Activation domain). Η μελέτη εστιάστηκε περισσότερο στην συνέργια που παρατηρήθηκε μεταξύ των συνενεργοποιητών CBP και P/CAF. Η μεταγραφική ενεργότητα του HNF-1 σε υποκινητή που έχει εντεθεί στο γένωμα των κυττάρων φαίνεται ότι εξαρτάται αυστηρά από την συνεργιστική δράση των δύο παραπάνω συνενεργοποιητών και απαιτεί τις HAT ενζυμικές ενεργότητες και των δύο σε αντίθεση με την επιλεκτική απαίτηση της HAT του P/CAF για την HNF-1-εξαρτώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση παροδικά διαμολυσμένου γονιδίου αναφοράς. Με in vitro πειράματα δείχθηκε ότι η πρόσδεση του CBP στο αμινοτελικό τμήμα του HNF-1 αυξάνει την συγγένεια πρόσδεσης του P/CAF στο καρβοξυτελικό γεγονός που παρέχει μία πιθανή εξήγηση για την παρατηρούμενη συνέργια μεταξύ των δύο συνενεργοποιητών. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο ο HNF-1 ενεργοποιεί την μεταγραφή στρατολογώντας διαφορετικούς συνενεργοποιητές οι οποίοι συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και διευκολύνουν πιθανότατα την μετέπειτα στρατολόγηση της γενικής μεταγραφικής μηχανής. Μελετώντας στη συνέχεια τον μηχανισμό έλλειψης μεταγραφικής ενεργότητας δύο φυσικών μεταλλαγών του HNF-1 των P519L και P447L που έχουν βρεθεί σε ασθενείς με νεανικό διαβήτη (MODY III), παρατηρήθηκε ότι οι μεταλλαγές αυτές αλληλεπιδρούν με μεγαλύτερη συγγένεια και με τους δύο συνενεργοποιητές CBP και P/CAF σε σύγκριση με την πρωτεΪνη αγρίου τύπου. Πιο λεπτομερής μελέτη έδειξε ότι η έλλειψη της μεταγραφικής ενεργότητας των μεταλλαγών αυτών δεν οφείλεται σε επιλεκτική αλληλεπίδραση τους με τον συγκαταστολέα NcoR ή την απακετυλάση HDAC1 αλλά οι συνενεργοποιητές CBP και P/CAF όταν βρίσκονται σε σύμπλοκο με τις μεταλλαγές εμφανίζουν μειωμένη HAT ενζυμική ενεργότητα. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη αγρίου τύπου - και όχι οι μεταλλαγές - αυξάνει την ΗΑΤ ενζυμική ενεργότητα του CBP in vitro. Στη συνέχεια δείχθηκε ότι και άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες όπως Sp1 και HNF-4 επάγουν την ενζυμική ενεργότητα του CBP. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών προσδίδουν στους μεταγραφικούς παράγοντες ένα πιο δυναμικό ρόλο στην διαδικασία της μεταγραφικής ενεργοποίησης. Δεν απαιτούνται μόνο για την στρατολόγηση συνενεργοποιητών στους υποκινητές αλλά φαίνεται πως τροποποιούν και την ενζυμική τους ενεργότητα. Στο τρίτο κομμάτι της εργασίας μελετάται ο ρόλος των HNF-4 και HNF-1 στις διαδικασίες συγκρότησης του προενακτήριου συμπλόκου και αναδιαμόρφωσης της χρωματινικής δομής στον υποκινητή φυσικού γονιδίου-στόχου τους. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε η σειρά στρατολόγησης των παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της α1-αντιτρυψίνης κατά την ενεργοποίηση του στη διάρκεια της διαφοροποίησης των εντερικής προέλευσης CaCo2 κυττάρων. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι ένα ολοκληρωμένο προενακτήριο σύμπλοκο που περιλαμβάνει τους δύο ενεργοποιητές HNF-4 και HNF-1, συστατικά του TFIID, τον γενικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIH, το σύμπλοκο των διαμεσολαβητών, καθώς και την φωσφορυλιωμένη μορφή της ΡΝΑ ΙΙ πολυμεράσης συγκροτείται στον συγκεκριμένο υποκινητή πολύ πριν από την χρονική στιγμή της μεταγραφιής έναρξης. Ακολουθεί η στρατολόγηση των ακετυλοτρανσφερασών CBP και P/CAF ενώ η παρατηρούμενη υπερακετυλίωση της ιστόνης H3 δεν συνοδεύει άμεσα την παραπάνω διαδικασία. Τέλος η παροδική στρατολόγηση του παράγοντα hBrm και η αναδιαμόρφωση του νουκλεοσώματος που καλύπτει το σημείο έναρξης της μεταγραφής συμπίπτουν με την χρονική στιγμή μεταγραφικής έναρξης. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης στον υποκινητή του γονιδίου της α1-αντιτρυψίνης είναι το τελευταίο καθοριστικό βήμα στη διαδικασία έναρξης της μεταγραφής μετά από την συγκρότηση του προενακτήριου συμπλόκου.
|
Μελέτη του μηχανισμού μεταγραφικής ενεργοποίησης από τους παράγοντες HNF-4 και HNF-1
