| Περίληψη |
Στα πλαίσια του προγράμματος της χαρτογράφησης του γονιδιώματος του ανθρώπου, στο πρώτο μέρος αυτής της διατριβής κατασκευάσαμε το φυσικό χάρτη υψηλής ευκρίνειας των πλούσιων σε γονίδια, περιοχών q23.3-q25 και q26.2-qter του χρωμοσώματος 10, μήκους ~35 Mb που ισοδυναμεί με περίπου το ? του μήκους του χρωμοσώματος. Για την κατασκευή του χάρτη, αρχικά διερευνήσαμε μια ολική γενωμική βιβλιοθήκη κλώνων BAC χρησιμοποιώντας κατά ομάδες, ~500 μοναδιαία τμήματα DNA (STS) από τις ανωτέρω χρωμοσωμικές περιοχές ως ανιχνευτές, και απομονώσαμε 3350 διακριτούς χρωμοσωμο-ειδικούς κλώνους. Οι κλώνοι αυτοί, σε συνδυασμό με εκείνους που με την ίδια προσέγγιση είχαν απομονωθεί από τους συνεργάτες μας στο Sanger Centre, απετέλεσαν την χρωμοσωμο-ειδική βιβλιοθήκη του 10, αποτελούμενη συνολικά από ~18.000 BACs. Η διερεύνηση αυτής της βιβλιοθήκης με κάθε ένα από τα παραπάνω STS, ξεχωριστά, μας οδήγησε στην λεπτομερή και απόλυτα αξιόπιστη αντιστοίχιση κάθε BAC με μια ομάδα από STSs. Τα δεδομένα μας, σε συνδυασμό με αυτά που προέκυψαν από τον προσδιορισμό του προτύπου ενζυμικού τεμαχισμού των αντίστοιχων BACs (Sanger Centre UK, Washington University St. Louis US) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή κατ αρχήν, επιμέρους contigs (ομάδες αλληλοεπικαλυπτόμενων κλώνων) τα οποία, βάσει των STS που περιείχαν, χαρτογραφούνταν κατά μήκος των ανωτέρω χρωμοσωμικών περιοχών. Για την επέκταση και σταδιακή ενοποίηση των contigs, καθορίσαμε με χρωμοσωμικό «περπάτημα», περίπου 80 νέους μοριακούς δείκτες από τα άκρα των τελικών/εξωτερικών κλώνων των contigs με τελικό αποτέλεσμα την κατασκευή ενός ενιαίου, υψηλής ευκρίνειας φυσικού χάρτη για την περιοχή 10q23.3-q25, μήκους περίπου 28 Mb. Η αξιοπιστία της σχετικής τοπογραφίας κάθε γενωμικής θέσης προκύπτει από το «βάθος» του contig στη περιοχή, όπως καθορίζεται από τον αριθμό των επικαλυπτόμενων κλώνων που επιβεβαιώνουν τη σχετική θέση. Σε κάθε περίπτωση, τουλάχιστον 8 επικαλυπτόμενα, λεπτομερώς χαρακτηρισμένα BACs, καθόριζαν κάθε χρωμοσωμική θέση. Με παρόμοια προσέγγιση, συγκροτήθηκε ο φυσικός χάρτης της υποτελομερικής περιοχής αποτελούμενος από δύο contigs μεγέθους 4,6Mb και 2Mb. Η ολοκληρωμένη αλληλούχηση των περιοχών 10q23.3-q25 και 10q26.2-qter από τους συνεργάτες μας (εργαστήριο αυτόματης αλληλούχησης DNA, Sanger Centre UK) έγινε βάσει των παραπάνω χαρτών. Για το σκοπό αυτό, επιλέχθηκε και αλληλουχήθηκε μία σειρά κλώνων BAC (~300), οι οποίοι διατρέχουν τις εν λόγω χρωμοσωμικές περιοχές καθ όλο το μήκος τους, εμφανίζουν την μέγιστη αξιοπιστία ως προς την τοπογραφία τους και παρουσιάζουν την ελάχιστη δυνατή αλληλοεπικάλυψη (minimal tiling path). Πλέον, η πλήρης αλληλουχία στις αντίστοιχες περιοχές, που περιέχουν 272 από τα 816 γονίδια του χρωμοσώματος που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και όπου χαρτογραφούνται 40 γενετικοί τόποι νοσημάτων, είναι σχεδόν ενιαία και ελεύθερα προσβάσιμη στο διαδίκτυο. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, αξιοποιήσαμε τον φυσικό χάρτη και την αλληλουχία του χρωμοσώματος 10 για να προσδιορίσουμε in silico, τον γονιδιακό χάρτη της περιοχής 10q23.3, μήκους 3Mb με στόχο τη ταυτοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με παθολογικούς φαινοτύπους. Εστιαστήκαμε σε αυτή την υποπεριοχή λόγω της σύνδεσης της, εκτός άλλων, με α) το γενετικό τόπο της αυτοσωμικής επικρατούς μερικής επιληψίας του πλάγιου κροταφικού λοβού (ADLTE) και β) την έκφραση της εύθραυστης χρωμοσωμικής θέσης FRA10A. Μετά το χαρακτηρισμό μιας σειράς γονιδίων της περιοχής, στα πλαίσια του ευρωπαϊκού consortium για την ADLTE, δείξαμε ότι μεταλλαγές στο γονίδιο LGI1, ευθύνονται για την εκδήλωση της ασθένειας. Το LGI1 μαζί με τρία ακόμη γονίδια, συγκροτεί μια διασκορπισμένη στο γονιδίωμα, οικογένεια με κοινά χαρακτηριστικά τις πρωτεϊνικές επαναλήψεις EPT και το μερικώς επικαλυπτόμενο πρότυπο έκφρασης στον εγκέφαλο. Η γενετική ετερογένεια της ADLTE ή άλλες νευρολογικές ασθένειες, ίσως εξηγούνται από την ύπαρξη αυτών των παράλογων γονιδίων LGI. Επίσης, με in silico διερεύνηση της αλληλουχίας του χρωμοσώματος για τρινουκλεοτιδικές επαναλήψεις (CGG)n, ταυτοποιήσαμε το γονίδιο FRA10AC1 που σχετίζεται με την εύθραυστη θέση FRA10A, και προχωρήσαμε στο χαρακτηρισμό του. Η κυτταρογενετική έκφραση της FRA10A οφείλεται στην επέκταση κατά ~200 φορές, της πολυμορφικής επανάληψης (CGG)n της 5 UTR του γονιδίου. Η επέκταση του (CGG)n οδηγεί στην υπερμεθυλίωση της περιοχής (αποτελέσματα από συνεργαζόμενο εργαστήριο) και συνεπάγεται την μεταγραφική καταστολή του γονιδίου. Το FRA10AC1 είναι μεταγραφικά ενεργό σε όλους τους ιστούς παρουσιάζοντας υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε όργανα με υψηλή μεταγραφική δραστηριότητα. Η ύπαρξη 5 εναλλακτικών μεταγράφων στις γονάδες, πιθανόν να συνεπάγεται αντίστοιχο αριθμό ισομορφών της πρωτεΐνης FRA10AC1, ετερογενών στο καρβοξυ-τελικό άκρο. Η πρωτεΐνη εντοπίζεται στον πυρήνα του κυττάρου και εμφανίζεται συντηρημένη στους πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς υποδηλώνοντας συμμετοχή σε μια βασική λειτουργία του κυττάρου. Με στόχο τη διερεύνηση του βιοχημικού ρόλου της πρωτεΐνης FRA10AC1, αξιοποιήσαμε το σύστημα των δύο υβριδίων στο σακχαρομύκητα που αποκάλυψε την αλληλεπίδρασή της με τις πρωτεΐνες SAP145 και DGCR14. Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της FRA10AC1 επιβεβαιώθηκαν με προσεγγίσεις in vitro και σε κυτταροκαλλιέργειες. Και οι δύο πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν, φαίνεται να συμμετέχουν σε κοινή βιολογική λειτουργία, στη διαδικασία συναρμογής του mRNA. Πράγματι, η SAP145 αποτελεί υπομονάδα του παράγοντα συναρμογής SF3b, ο οποίος συμμετέχει στο σχηματισμό του U2 snRNP, συστατικό του μείζονος spliceosome και η DGCR14 έχει απομονωθεί βιοχημικά ως πρωτεΐνη-συστατικό του ίδιου συμπλόκου. Καθώς και οι δύο σχετίζονται με τη διαδικασία της συναρμογής του mRNA, τα αποτελέσματά μας συνηγορούν στην συμμετοχή της FRA10AC1 σε αυτήν την διαδικασία ή εναλλακτικά σε άλλες λειτουργικά συσχετιζόμενες, διαδικασίες σύνθεσης, επεξεργασίας ή/και διακίνησης του mRNA.
|
Φυσικός χάρτης προς αλληλούχηση της περιοχής q23.3-q25.3 του χρωμοσώματος 10 του ανθρώπου και ανάλυση του γονιδίου FRA10AC1
