Περίληψη |
Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας είναι η μελέτη δυο μεταλλαγμάτων της πρωτεΐνης HrpA από το φυτοπαθογόνο Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. H HrpA, η οποία είναι πιλίνη της Pseudomonas syringae, είναι μια μικρή υδροφιλική πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο hrpA. Λαμβάνοντας υπόψιν ότι το καρβοξυτελικό άκρο της θεωρείται υπεύθυνο για τον πολυμερισμό της καθώς και τον αμφιπαθητικό χαρακτήρα της καρβοξυτελικής προβλεπόμενης α έλικας της HrpA από P. syringae pv. phaseolicola, σχεδιάστηκαν δυο γονιδιακές κατασκευές με 8 και 18 υπολειπόμενα αμινοξικά κατάλοιπα (HrpAΔC8, HrpAΔC18, αντίστοιχα), προκειμένου να αποφευχθεί αυθόρμητος πολυμερισμός, ο οποίος θα εμπόδιζε τη κρυστάλλωση τους.
Τα δυο αυτά μεταλλάγματα υπερεκφράστηκαν και απομονώθηκαν με χρωματογραφία συγγένειας και στη συνέχεια με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Επιπλέον, μελέτη της δευτεροταγούς δομής τους σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας, συγκέντρωσης και pH, πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του κυκλικού διχρωισμού. Σύμφωνα με την ανάλυση δεδομένων κυκλικού διχρωισμού, υπάρχει ένα πολύ μικρό προβλεπόμενο ποσοστό α-έλικας (10 %), ενώ τα προβλεπόμενα ποσοστά των β-πτυχωτών και τυχαίου σπειράματος είναι παρόμοια (20-30 %), ανεξάρτητα από τις διαφορετικές συνθήκες που δοκιμάστηκαν κάτι που έρχεται σε αντίθεση με την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής με τη βοήθεια του αλγόριθμου PSIPRED. Παράλληλα, έγιναν πειράματα θερμοεπαγόμενης αποδιάταξης των μεταλλαγμάτων, τα οποία έρχονται σε αντίθεση με τη θεωρία της εύπλαστης σφαίρας για την πρωτεϊνική αναδίπλωση. Επιχειρήθηκε προκαταρκτική δομική μελέτη με τη μέθοδο σκέδασης ακτίνων Χ από διάλυμα σε μικρές γωνίες, ωστόσο οι μετρήσεις δεν ήταν επαρκείς ώστε να αποδώσουν τρισδιάστατα μοντέλα των μεταλλαγμάτων. Τέλος, οι υπό μελέτη πρωτεΐνες ελέγχθηκαν για την ικανότητα τους στην παραγωγή κρυστάλλων με διαφορετικές τεχνικές, και σε ποικίλες συνθήκες.
|