Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Επιπτώσεις της αλληλεπίδρασης της gp120/V3 HIV-1 και του συνυποδοχέα CCR5 σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000379028
Τίτλος Επιπτώσεις της αλληλεπίδρασης της gp120/V3 HIV-1 και του συνυποδοχέα CCR5 σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο
Άλλος τίτλος The impact of the interaction of gp120 of HIV-1 with receptor CCR5 on cellular and molecular level
Συγγραφέας Μώρου, Αντιγόνη Κ
Σύμβουλος διατριβής Σπαντίδος, Δημήτριος
Μέλος κριτικής επιτροπής Σαμώνης, Γεώργιος
Ζαφειρόπουλος, Αλέξανδρος
Παπαδάκη, Ελένη
Ηλιόπουλος, Α.
Τσατσάνης, Χρήστος
Περίληψη Η ασυμπτωματική φάση της μόλυνσης από τον HIV-1 χαρακτηρίζεται από τη σταδιακή μείωση του πληθυσμού των μη μολυσμένων περιφερικών CD4+ Τ κυττάρων που οδηγεί σε ανοσοανεπάρκεια και στην εκδήλωση των συμπτωμάτων του AIDS. Εντούτοις, ο ακριβής μηχανισμός αυτής της κυτταροπαθογένειας δεν είναι πλήρως κατανοητός. Σύμφωνα με μελέτες που έχουν προηγηθεί από την ερευνητική ομάδα μας, έχει προταθεί ότι οι πρωτεΐνες του ιικού φακέλου συμμετέχουν σε μία ιδιότυπη «ανοσο-ιική σύναψη» μεταξύ του μολυσμένου με HIV μακροφάγου και CD4+ Τ κυττάρων κατά την αντιγονοπαρουσίαση. Στη σύναψη, η V3 περιοχή της gp120 αλληλεπιδρά τουλάχιστον με τον υποδοχέα χημειοκινών CCR5 και επάγει μία μορφή ταχείας και ενισχυμένης απόπτωσης, που ονομάζεται AICD (activation-induced cell death) στα αποκρινόμενα CD4+ Τ κύτταρα. Έχει δειχθεί η ιοντική φύση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των θετικά φορτισμένων αμινοξέων στην V3 περιοχής και των αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων του ελεύθερου αμινοτελικού άκρου του CCR5 και ότι συνθετικά φορτισμένα V3 πεπτίδια μπορούν να αναστείλουν τον AICD των CD4+ T κυττάρων, αλλά να παρεμποδίσουν την μόλυνση πρωτογενών κυττάρων από τον HIV. Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν η αποκρυπτογράφηση των αρχικών σηματοδοτικών μορίων που πυροδοτούνται από την αλληλεπίδραση του επίτοπου V3 με τουλάχιστον τον συνυποδοχέα CCR5 προκαλώντας ανοσολογική δυσλειτουργία των αποκρινόμενων CD4+ T κυττάρων και η διερεύνηση του ρόλου του επιτόπου V3 στο μη φυσιολογικό φαινόμενο του επαγώμενου από ενεργοποίηση κυτταρικού θανάτου μη μολυσμένων CD4+ T κυττάρων. Για να αναπαραχθεί το βιολογικό φαινόμενο in vitro, πρωτογενή μακροφάγα εκτέθηκαν σε λιποσώματα τα οποία έφεραν στην επιφάνειά τους γραμμικά, συνθετικά λιποπεπτίδια από το στέμμα του V3 και προκλήθηκε ο σχηματισμός συμπλόκου αντιγονοπαρουσίασης μεταξύ των μακροφάγων και CD4+ T κυττάρων μέσω ενός συστήματος ψευδοαντιγονοπαρουσίασης. Η επίδραση του επιτόπου HIV-1/V3 στο μεταγραφικό προφίλ σε ένα CD4+ εμπλουτισμένο Τ κυτταρικό πληθυσμό κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης προσδιορίστηκε με τη χρήση μικροσυστοιχιών συμπληρωματικού DNA. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι 440 γονίδια επηρεάστηκαν σε επίπεδο mRNA από την παρουσία του V3 (>2.0 fold-change, p<0,05, t-test): 378 γονίδια αύξησαν τα μεταγραφικά τους επίπεδα, από τα οποία μάλιστα 18 παρουσίασαν αύξηση τουλάχιστον 10 φορές, ενώ για 62 γονίδια παρατηρήθηκε μείωση. Tα γονίδια τα οποία παρουσίασαν τις εκτενέστερες μεταγραφικές μεταβολές σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και τη μεταγραφική ρύθμιση. Ακολούθησε η λειτουργική κατηγοριοποίηση των σημαντικά τροποποιημένων γονιδίων και η αναγνώριση των τροποποιημένων αναγνωρισμένων μονοπατιών και λειτουργικών δικτύων με τη χρήση της πλατφόρμας Ingenuity Pathways Analysis (IPA) platform και η υπεραντιπροσώπευση λειτουργικών οντολογιών με τη βοήθεια του DAVID Bioinformatics Resources. Οι στατιστικά σημαντικότερες εμπλουτισμένες κατηγορίες και δίκτυα που αναγνωρίστηκαν από το ΙΡΑ αφορούσαν τον κυτταρικό κύκλο, τη γονιδιακή έκφραση, την ανοσολογική απάντηση, τους μηχανισμούς μόλυνσης, την κυτταρική αύξηση, τον πολλαπλασιασμό και την αντιγονοπαρουσίαση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι επίτοπος V3 μεταβάλλει το μονοπάτι σηματοδότησης μέσω του συνυποδοχέα CD28. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα πρότυπο γονιδιακής έκφρασης που υποστηρίζει τον υπερπολλαπλασιασμό, που πυροδοτείται από την αλληλεπίδραση V3-CCR5 στα CD4+ Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης και το οποίο θα μπορούσε να λογοδοτήσει για τον AICD μη μολυσμένων CD4+ Τ κυττάρων στη μόλυνση από τον HIV-1. Καθώς ο κυτταρικός κύκλος ήταν η σημαντικότερη λειτουργία του κυττάρου που τροποποιήθηκε από το V3 σύμφωνα με την ανάλυση της βιοπληροφορικής, μελετήθηκε η επίδραση του V3 στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων. Το στάδιο του κυτταρικού κύκλου ενός CD4+ εμπλουτισμένου κυτταρικού πληθυσμού που έχει επωαστεί με τον επίτοπο V3 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής και παρατηρήθηκε μία αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στις φάσεις S και G2/M όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με τον επίτοπο V3. Η πρωτεϊνική έκφραση της MKi67, η οποία διαδραματίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στη φάση του πολλαπλασιασμού, εκτιμήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού, και η παρατηρηθείσα αύξηση των MKi67 θετικών Τ κυττάρων σε απάντηση στον επίτοπο V3 επιβεβαίωσε το αποτέλεσμα των μικροσυστοιχιών αναφορικά με τη μεταγραφική αύξηση του γονιδίου ΜΚi67. Τα μεταγραφικά επίπεδα του γονιδίου της CCNB1, το οποίο κωδικοποιεί για μία ρυθμιστική πρωτεΐνη που εκφράζεται στη φάση G2/M ελέγχοντας τη μίτωση, παρουσίασαν αύξηση σε απόκριση στο V3 προτείνοντας ότι η CCNB1 ίσως συμβάλλει καταλυτικά στην απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η θεαματική αύξηση των επιπέδων mRNA του NOC2L, ενός πρόσφατα ανακαλυμμένου γονιδίου το οποίο επηρεάζει τη λειτουργία του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζοντας τη μεταγραφή μέσω p21 και αναστέλλει την απόπτωση μέσω p53 και p63. Η κινητική μελέτη των επιπέδων mRNA του NOC2L η οποία έδειξε αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων που ακολουθείτο από μία απότομη μείωση, θα μπορούσε να διαδραματίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στον παρατηρούμενο κυτταρικό θάνατο κατά τη μόλυνση από τον HIV-1. Λόγω του ιδιαίτερου ενδιαφέροντος που παρουσιάζει η τροποποίηση του CD28 συνδιεγερτικού μονοπατιού από τον επίτοπο V3 καθώς ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση αυξάνοντας τη μεταγραφική έκφραση της IL2, μελετήθηκε περαιτέρω το μόριο με τη μεγαλύτερη μεταγραφική αύξηση σύμφωνα με τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών, που συμμετέχει στο μονοπάτι αυτό, ο μεταγραφικός παράγοντας NFAT5 (nuclear factor of activated T-cells 5). Η κινητική ανάλυση των μεταγραφικών επιπέδων του ΝFAT5 με ημιποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου επιβεβαίωσε την αύξηση των mRNA του ΝFAT5, και η αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση της επιβεβαιώθηκε με western blotting και κυτταρομετρία ροής. Για να επιβεβαιωθεί η βιολογική δράση του NFAT5 στο V3 φαινόμενο, χρησιμοποιήθηκε η κυκλοσπορίνη Α (cyclosporine A, CsA) η οποία παρεμποδίζει την ενεργοποίηση των NFAT. Σε τεχνικές μέτρησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, δείχθηκε ότι η CsA επομένως δύναται να αναστείλει το V3 φαινόμενο, γεγονός που υποστηρίζει τον πρωταγωνιστικό ρόλο του ΝFΑΤ5 στο φαινόμενο. Η εκτίμηση των μεταγραφικών επιπέδων της ιντερλευκίνης 2, το τελικό αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του CD28 μονοπατιού, απέδειξε αύξηση της μεταγραφικής έκφρασης της ιντερλευκίνης 2, επιβεβαίωνοντας την τροποποίηση του CD28 μονοπατιού από V3 σε λειτουργικό επίπεδο. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνουν ότι κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης το V3 επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων μεταβάλλοντας τα μεταγραφικά επίπεδα των NOC2L, CCNB1 και MKi67, με αποτέλεσμα την αύξηση των κυττάρων που βρίσκονται στις φάσεις πολλαπλασιασμού S και της G2/M, και φαλκιδεύει το μονοπάτι του CD28, επιτείνοντας κυρίως τη μεταγραφή των NFAT5 και IL2. Λόγω της κλινικής σημασίας της μελέτης μας, ήταν επιβεβλημένο να επεκτείνουμε τα ευρήματα μας σε άτομα μολυσμένα από τον HIV-1 χρησιμοποιώντας δείγματα αίματος. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο του Dr Kaufmann στο Ragon Institute of MGH, Harvard & MIT στη Βοστόνη εκτιμήθηκαν τα μεταγραφικά επίπεδα επιλεγμένων γονιδίων που αναδύθηκαν από την ανάλυση του μεταγραφώματος των CD4+ T κυττάρων στο in vitro μοντέλο, σε ασθενείς που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια της ασθένειας. H μελέτη της έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων (NOC2L, MKI67, CCNB1, CCND2,PDPK1 NFAT5, PI3KR1, PAK1, IFI6) σε ΗIV-1 μολυσμένα άτομα με υψηλό ιικό φορτίο (VL), σε ΗΙV-1 μολυσμένα άτομα σε θεραπεία, και σε elite controllers αποκαλύπτει πολύτιμες πληροφορίες για τα ανοσολογικά στοιχεία που εμπλέκονται στη δραματική μείωση των μη μολυσμένων CD4+ T κυττάρων κατά τη μόλυνση με τον HIV. Ανάμεσα στα πιο σημαντικά αποτελέσματα ήταν η στατιστικά σημαντική μείωση των μεταγραφικών επιπέδων του NOC2L σε άτομα που έχουν μολυνθεί από τον HIV-1 σε σύγκριση με τα υγιή άτομα, και δείχθηκε ότι η ποσότητα του mRNA συνδέεται αντιστρόφως ανάλογα με το ιικό φορτίο. Επίσης δείχθηκε ότι τα HIV-1(+) άτομα είχαν αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα για το Ki67 σε σχέση με τους υγιείς δότες και υπήρχε άμεση συσχέτιση με το ιικό φορτίο. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση ότι οι elite controllers έχουν υψηλή έκφραση επίπεδο μεταγραφής των γονιδίων Κi67 και CCNB1, τα οποία κωδικοποιούν για μόρια κλειδιά στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν πως ο HIV-1 επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων και τοιουτοτρόπως ίσως επηρεάζει την πορεία της ασθένειας. O επίτοπος V3 έχει επανέλθει στο προσκήνιο ως στόχος εξουδετεροποιητικών αντισωμάτων, όταν πρόσφατα προσδιορίστηκε η τρισδιάταση δομή της. Εντούτοις, ο ακριβής ρόλος του V3 παραμένει αινιγματικός. Η σκιαγράφηση των μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων το V3 καταδικάζει τα μη μολυσμένα CD4+ T κύτταρα σε AICD καθίσταστη επιβεβλημένη, καθώς θα μπορούσε να λογοδοτήσει για την προοδευτική ελάττωση των των CD4+ Τ κυττάρων, παρά το γεγονός ότι μόνο το 0,001-0,1% των Τ κυττάρων είναι μολυσμένα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προσδίδουν ενδεικτικά στοιχεία για τη διαμόρφωση ενός μεταγραφικού προφίλ που οδηγεί τα CD4+ Τ κύτταρα σε υπερπολλαπλασιασμό από την συνδιέγερση του V3 μέσω του CCR5 κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης. Η εκτίμηση των μεταγραφικών επιπέδων γονιδίων που επηρεάζονται από το V3 σε CD4+ T κύτταρα από μολυσμένα με HIV-1 άτομα υπογράμμισε τη ρόλο γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ο προσδιορισμός των μορίων-κλειδιά που συμμετέχουν στη σηματοδότηση μέσω V3 στα CD4+ HIV, δύναται να οδηγήσει στο σχεδιασμό καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών κατά του AIDS.
Φυσική περιγραφή xiv, 148 σ : πιν. ; 23 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά, Αγγλικά, Αγγλικά
Θέμα Activation- induced cell death
CD4+ T cells
CD4+ T κύτταρα
Cell cycle
Glycoprotein GP120
HIV
HIV Envelope Proteins gp120
Human immunodeficiency virus (HIV-1)
Novel INHAT repressor (NIR)
Nuclear factor of activated T-Cells (NFATS)
Transcriptional profile
Ανθρώπινος ιός ανοσοανεπάρκειας
Γλυκοπρωτεϊνη GP120
Επαγόμενος από ενεργοποίηση κυτταρικός θάνατος
Κυτταρικός κύκλος
Μετεγραφικό προφίλ
Νέος αναστολέας των INHAT
Πυρηνικός πατάγοντας ενεργοποιημένων Τ κυττάρων
Ημερομηνία έκδοσης 2012-07-24
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 80

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 7