| Περίληψη |
Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η κινητική συμπεριφορά των φλαβινών: φλαβινομονονουκλεοτίδιο (Flavin Mononucleotide-FMN) και φλαβινοαδενινοδινουκλεοτίδιο (Flavin Adenine Dinucleotide-FAD), συμπαράγοντων του ενζύμου οξειδοαναγωγάση του κυτοχρώματος P450 (P450 oxidoreductase-POR).
Το ένζυμο POR συμμετέχει σε πληθώρα βιοχημικών μονοπατιών και ως εκ τούτου είναι σημαντικός ο προσδιορισμός του ακριβούς μηχανισμού λειτουργίας του στις διάφορες οξειδοαναγωγικές διεργασίες.
Η μελέτη των συγκεκριμένων φλαβινών και ειδικότερα των φωτοφυσικών και φωτοχημικών διεργασίων στις οποίες αυτοί οι συμπαράγοντες συμμετέχουν οδηγεί στην εξαγωγή μηχανιστικών πληροφοριών που συνεισφέρουν στην κατανόηση της λειτουργίας του ενζύμου POR.
Για τη διεξαγωγή της μελέτης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της υπερταχείας χρονοαναλυόμενης φασματοσκοπίας λέιζερ (Ultrafast Time-Resolved Laser Spectroscopy). Χαρακτηριστικό της τεχνικής είναι η χρήση παλμού λέιζερ μέσω του οποίου επιτυγχάνεται διέγερση των μορίων της φλαβίνης εντός εξαιρετικά μικρού χρονικού διαστήματος (30×10-15 s). Ο περιορισμένος χρόνος της διαδικασίας διαταραχής του συστήματος επιτρέπει την ανίχνευση και φασματοσκοπική παρακολούθηση υπερταχειών διαδικασιών μέσω μεταβολών στην απορρόφηση που προκύπτουν από το σχηματισμό και αλληλο-μετατροπή διεγερμένων καταστάσεων και ενδιαμέσων. Ειδικότερα, για τη διέγερση των φλαβινών χρησιμοποιήθηκαν παλμοί λέιζερ, μήκους κύματος λ = 400 nm, οι οποίοι οδηγούν σε διέγερση των ενώσεων στις ηλεκτρονιακές καταστάσεις S1 και S2.
Τα χρονοαναλυόμενα φάσματα απορρόφησης του FMN, που καταγράφονται αμέσως μετά τη διέγερση και για διάφορες χρονικές στιγμές σε εύρος μέχρι και 50×10-12 s, εμφανίζουν τέσσερεις χαρακτηριστικές ταινίες οι οποίες οφείλονται στη μετάβαση S0S1 (450 nm), στην εξαναγκασμένη εκπομπή S1S0 (560 nm), καθώς και σε απορρόφηση της κατάστασης S1 προς ανώτερες διεγερμένες καταστάσεις, S1Sn (505 nm και 600 nm). Από τα χρονοαναλυόμενα φάσματα προκύπτουν κινητικές καμπύλες, που αποτυπώνουν την κινητική των καταστάσεων S0 και S1 του FMN. Το αποτέλεσμα είναι σε συμφωνία με τη βιβλιογραφία, στην οποία αναφέρεται αργή αποδιέγερση της S1 προς S0 με χρόνο ζωής της τάξης των μερικών νανοδευτερολέπτων (5.4×10-19 s). Επιπροσθέτως η ανάλυση των κινητικών καμπυλών φανερώνει μια ταχεία διεργασία με χρόνο ζωής της τάξης των 1-2 πικοδευτερολέπτων (1×10-12 s) και αποδίδεται στην αποδιέγερση (εσωτερική μετατροπή) της διεγερμένης κατάστασης S2 προς την S1.
Στην περίπτωση του FAD παρατηρήθηκαν οι αντίστοιχες μεταβάσεις ως προς το FMN, με όμοια φασματικά χαρακτηριστικά. Η ανάλυση των δεδομένων αποκαλύπτει δυο κινητικές συνιστώσες, μια υπερταχεία με χρόνο ζωής της τάξης των 5-12 πικοδευτερολέπτων (1×10-12 s) ακολουθούμενη από μια πολύ αργή που δεν αναλύεται περαιτέρω λόγω του μικρού χρονικού διαστήματος της μέτρησης αλλά αποδίδεται στην αργή αποδιέγερση της S1 προς S0. Τα αποτελέσματα συμφωνούν με την βιβλιογραφία, στην οποία ο υπερταχύς χρόνος ζωής, 5-10×10-12 s, συνδέεται με την παρουσία διαμόρφωσης του FAD στην οποία ο δακτύλιος της ισοαλλοξαζίνης ευρίσκεται σε μικρή απόσταση από το δακτύλιο αδενίνης με αποτέλεσμα την αλληλεπίδραση των δυο μέσω διεργασίας μεταφοράς ηλεκτρονίου.
Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποδεικνύουν τις δυνατότητες της υπερταχείας χρονοαναλυόμενης φασματοσκοπίας λέιζερ για τη λεπτομερή διερεύνηση κινητικών φαινομένων σε υψηλή χρονική ανάλυση. Η μέθοδος θα χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτη και κατανόηση των φωτοφυσικών διεργασιών σε απλά συστήματα φλαβινών, αλλά κυρίως σε πιο πολύπλοκα βιολογικά μόρια όπως το POR.
|
Υπερταχεία χρονοαναλυόμενη φασματοσκοπία λέιζερ στη μελέτη των φλαβινών FMN και FAD, συμπαραγόντων της οξειδοαναγωγάσης του κυτοχρώματος P450
