| Περίληψη |
Οι λεισμανιάσεις είναι μια ομάδα ασθενειών που προσβάλουν τον άνθρωπο και μερικά ζώα. Κατανέμονται σε όλες τις τροπικές και εύκρατες περιοχές του πλανήτη εκτός από την Αυστραλία. Η νόσος προκαλείται από το παράσιτο του γένους λεϊσμάνια (Protozoa: Trypanosomatidae) και μεταδίδεται από σκνίπες του γένους Phlebotomus (Diptera: Psychodidae). Έχουν ανιχνευθεί 21 είδη φλεβοτόμων που δρούν σαν ενδιάμεσοι ξενιστές και μπορούν να μολύνουν τον άνθρωπο και πολλά είδη ζώων (σκυλιά, σαρκοφάγα θηλαστικά, τρωκτικά και βραδύποδα) που με την σειρά τους χρησιμεύουν σαν υπόδοχα του παρασίτου. Η οικολογία και η επιδημιολογία καθιστά αναμφίβολα τις λεϊσμανιάσεις μια από τις πιο πολυμορφικές αρμπολοιμώξεις. Οι επιδημιολογικές μελέτες της λεϊσμανίασης περιλαμβάνουν την ταυτοποίηση του ενδιάμεσου ξενιστή, με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά. Η μεθοδολογία αυτή απαιτεί εξειδίκευση, εξ' αιτίας της διαφοροποίησης των ειδών που κρίνεται από λεπτά μορφολογικά χαρακτηριτικά. Άλλες μέθοδοι όπως μορφομετρικές, ισοενζυματική ηλεκτροφόρηση και χρήση ραδιενεργών DNA ανιχνευτών θέτουν περιορισμούς στην ευρεία χρήση τους ως πολύπλοκες και χρονοβόρες. Ετσι δημιουργείται η αναγκαιότητα της ανάπτυξης μοριακών τεχνικών για την τυποποίηση των φλεβοτόμων. Στο πρώτο μέρος αυτής της εργασίας περιγράφεται η ανάπτυξη μιας απλής και αξιόπιστης μεθόδου για την τυποποίηση των φλεβοτόμων. Βασίζεται στην ανίχνευση πολυμορφικών χαρακτήρων στην νουκλεοτιδική ακολουθία του 18S rDNA με την χρήση PCR και επιλεγμένων περιοριστικών ενζύμων. Χρησιμοποιήθηκαν 10 είδη φλεβοτόμων από την Ελλάδα και την Κύπρο που είχαν συλλεχθεί κατά την διάρκεια επιδημιολογικών και εντομολογικών μελετών. Παρατηρήθηκε η ύπαρξη συντηρημένων περιοριστικών θέσεων για κάθε είδος, που παράγουν συντηρημένα και ειδικά περιοριστικά προφίλ με την χρήση αντιστοίχων ενζύμων. Η μέθοδος εφαρμόστηκε και έδωσε ασφαλή αποτελέσματα ακόμα και σε έντομα των οποίων οι μορφολογικοί χαρακτήρες ήταν δυσδιάκριτοι, εξ' αιτίας λεπτών διαφορών, ή κακής συντήρησης. Είναι δε εφαρμόσημη σε όλα τα στάδια ανάπτυξης του εντόμου και όχι μόνον στο τέλειο ενήλικο άτομο. Η δυνατότητα ασφαλούς χρήσης της τεχνικής χωρίς την ύπαρξη εξειδικευμένων στην μορφολογική τυποποίηση ερευνητών, κάνει την μέθοδο εφαρμόσημη σε ευρεία κλίμακα στις έρευνες πεδίου. Για τις επιδημιολογικές μελέτες των αρμπολοιμώξεων είναι σημαντικό να μελετηθούν ταυτοχρόνως οι φυλογενετικές σχέσεις των ειδών του παθογόνου και του ενδιάμεσου ξενιστή καθώς και η αλληλεπίδρασή τους εν όψη της διερεύνησης των σύγχρονων εξελικτικών φαινομένων. Έτσι, η μελέτη προχώρησε πέρα από την ανίχνευση των πολυμορφικών περιοριστικών θέσεων του 18S rDNA για την τυποποίηση των φλεβοτόμων, στην ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των διαφόρων ειδών. Η φυλογενετική ανάλυση διερευνά την εξελικτική πορεία των υπό μελέτην ειδών και πληροφορίες σχετικές με την ύπαρξη διακριτών υποπληθυσμών μπορεί να είναι επιδημιολογικά σημαντικές. Για την μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 70 άτομα φλεβοτόμων που ανήκουν σε 15 είδη και 3 γένη και τα οποία περισυνελλέγησαν σε σταθμούς από την Ελλάδα και την Κύπρο. Στούς φλεβοτόμους οι σχέσεις αναλύθηκαν στο επίπεδο του υπο-γένους και του είδους. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν το υπογένος Euphlebotomus να αποτελεί την βάση των υπογενών Larroussius και Adlerius. Αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα φυλογενετικών μελετών με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά. Επιπλέον το αποτέλεσμα αυτό είναι επιδημιολογικά σημαντικό διότι σ' αυτά τα υπογένη ταξινομούνται τα περισσότερα είδη ενδιαμέσων ξενιστών του συμπλέγματος της Leishmania donovani. Τα επιδημιολογικά δεδομένα της λεισμανίασης έχουν αλλάξει τα τελευταία χρόνια, κυρίως στην περιοχή της Μεσογείου, όπου η ασθένεια ήταν παραδοσιακά ζωονόσος. Η λεισμανίαση θεωρείται σημαντική ευκαιριακή λοίμωξη, δεδομένου οτι μεγάλο ποσοστό ανοσοκατεσταλμένων ασθενών πάσχουν από την ασθένεια. Για τον λόγο αυτό οι ορολογικές διαγνωστικές μέθοδοι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα. Μοριακές διαγνωστικές τεχνικές έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί, στηρίζονται δε στον πολλαπλασιασμό και ανίχνευση ποικίλων τμημάτων DNA του παρασίτου. Με στόχο την ανάπτυξη μεθόδων που θα χρησιμοποιηθούν στην διάγνωση στον άνθρωπο αλλά και στον ενδιάμεσο ξενιστή αναπτύχθηκε, στο τρίτο μέρος αυτής της εργασίας, μια μέθοδος που βασίζεται στον πολλαπλασιασμό και ανίχνευση τμήματος DNA του μινικύκλου. Για την ανίχνευση του παρασίτου στον ξενιστή απαιτείται μεγάλη ευαισθησία, έτσι χρησιμοποιήθηκαν τρείς εναρκτές, σε δύο στάδια πολλαπλασιασμού, (semi- nested PCR) σε μία δοκιμασία που έχει την ικανότητα να ανιχνεύει 3 παράσιτα/ έντομο. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε στα έντομα από την ενδημική περιοχή της Αττικής και τα αποτελέσματα έδειξαν μολυσμένα έντομα σε ποσοστό 6,2%. Έκπληξη ήταν η κατανομή των μολυσμένων εντόμων στα είδη: Στην Ελλάδα αποδεδειγμένος ενδιάμεσος ξενιστής είναι ο P. neglectus και πιθανός ο P. tobbi (υπογένος Larroussius). Μολυσμένοι όμως βρέθηκαν, εκτος των προανεφερθέντων, και τα είδη P. simici (υπογένος Adlerius) , P. alexandri και P. papatasi, είδη που δεν θεωρούνται ξενιστές. Αν και για τον P. papatasi δεν υπάρχουν άλλα στοιχεία που να υπονοεί τον ρόλο του ξενιστή, ο P. simici και P. alexandri είναι αποδεδειγμένοι ξενιστές της L. infantum και L. donovani αντίστοιχα στην Ασία. Με δεδομένη την στενή φυλογενετική σχέση των Larroussιus και Adlerius όπως περιγράφεται στο δεύτερο μέρος της εργασίας και των επιδημιολογικών δεδομένων μπορούμε να υποθέσουμε τον πιθανό ρόλο ξενιστή του P. simici και στην Ελλάδα. H συντονισμένη χρήση της μεθοδολογίας που περιγράφεται δίδει σημαντικές πληροφορίες για την ταυτοποίηση των μεταβιβαστών της λεϊσμάνιας, την ανίχνευση ενεργών ενδημικών περιοχών και την παρακολούθηση της "κυκλοφορίας" μολυσματικών στελεχών του παρασίτου στις ενδημικές περιοχές.
|
Διερεύνηση της Γενετικής Ποικιλομορφίας των Αρθροποδών Διαβιβαστών της Λεϊσμανίας και Ανάπτυξη Μοριακών Επιδημιολογικών Μεθόδων
