| Περίληψη |
Οι λεπτές μεμβράνες (ΛΜ) που καλύπτουν τους πόρους μεταξύ των ποδικών εκβλαστήσεων (ΠΕ) γειτονικών ποδοκυττάρων είναι βασικές δομές του σπειραματικού ηθμού όπου γίνεται η υπερδιήθηση του πλάσματος στο νεφρικό σπείραμα.
Πιθανή διαταραχή στις ΛΜ και στα βασικά συστατικά τους, τη νεφρίνη και την ποδοσίνη, ενέχεται στην παθογένεια της σπειραματονεφρίτιδας με πρωτεϊνουρία που οφείλεται σε ανοσολογικούς μηχανισμούς. Διεξήγαμε μελέτη σε πειραματόζωα και σε ανθρώπους με σκοπό να καθορίσουμε της έκφραση της νεφρίνης και της ποδοσίνης στις διάφορες ιστολογικές μορφές της νεφρίτιδας του λύκου (ΝΛ), μια νόσο πρότυπο για τις νεφρίτιδες με αυτοάνοση αρχή, της οποίας χαρακτηριστική κλινική εκδήλωση είναι η πρωτεϊνουρία.
Οι νεφροί εξετάστηκαν με φωτονικό μικροσκόπιο (ΦΜ) και με ανοσοφθορισμό ΙgG για να προσδιοριστούν τα χαρακτηριστικά της ΝΛ. Η εξέταση συμπληρώθηκε και με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Βασιζόμενοι στα ευρήματα από την εξέταση με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, προσδιορίσαμε στη συνέχεια τη σπειραματική έκφραση της ολικής νεφρίνης και ποδοσίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο με ανάλυση western blot σε θηλυκά NZB/W ποντίκια, φυσιολογικά στο ΦΜ (n=11), με ήπια μεσαγγειακή υπερπλασία (ΗΜΝΛ) (n=5), με εστιακή (ΕΥΝΛ) (n=6) και διάχυτη υπερπλαστική νεφρίτιδα (ΔΥΝΛ) (n=4) καθώς και σε ποντίκια C57BL/6 (n=24) αντίστοιχης ηλικίας και φύλου που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου, όπως επίσης και σε NZB (n=5) και NZW (n=4) ποντίκια. Η έκφραση της νεφρίνης εξετάστηκε επίσης με ανοσοφθορισμό στα παρασκευάσματα του νεφρικού ιστού. Για να προσδιορίσουμε εάν οι μεταβολές της νεφρίνης και της ποδοσίνης οφείλονται σε μεταβολή της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων, προσδιορίσαμε το mRNA στα ίδια δείγματα, με ποσοτική αντίστροφη real time PCR. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματα μας στα πειραματόζωα εξετάσαμε με ανοσοϊστοχημεία την έκφραση της νεφρίνης σε ασθενείς με διάφορους τύπους ΝΛ: τάξης II (n=5), IV (n=4), V (n=7) και σε υγιείς μάρτυρες (n=2).
Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Για τις συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκαν οι έλεγχοι Mann-Whitney U-test (αριθμητικές μεταβλητές) και το Fisher's exact test (κατηγορικές μεταβλητές).
Οι μεταβολές στα ΛΔ, όπως προσδιορίστηκαν με την εξέταση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο συσχετίζονται με την ιστολογική εικόνα στα θηλυκά NZB/W ποντίκια. Η σοβαρότητα των μεσαγγειακών, υπό-ενδοθηλιακών και υπό-επιθηλιακών εναποθέσεων, καθώς και η εξάλειψη των ΠΕ συσχετίζονταν σημαντικά με την 24ωρη πρωτεϊνουρία. (ρ=0.85, p<0.003) και την ένταση του ανοσοφθορισμού IgG (ρ=0.90, p<0.001). Η αναλύσεις με Western blot και ανοσοφθορισμό ανέδειξαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα νεφρίνης στα ποντίκια με ΕΥΝΛ ή ΔΥΝΛ (p<0.05 για όλες τις ανά ζεύγη συγκρίσεις). Τα επίπεδα ποδοσίνης ήταν επίσης σημαντικά μειωμένα στις ίδιες ομάδες ποντικιών (p<0.05). Τα επίπεδα και των δύο πρωτεϊνών ήταν σημαντικά μειωμένα στα ποντίκια NZB/W με εκτεταμένη εξάλειψη ΠΕ (p<0.05 και για τις δύο). Τα επίπεδα του σπειραματικού mRNA της νεφρίνης και της ποδοσίνης ήταν σημαντικά μειωμένα στην ΔΥΝΛ - αλλά όχι στη ΕΥΝΛ (p=0.034). Βρήκαμε καλή συσχέτιση μεταξύ των επίπεδων mRNA νεφρίνης και ποδοσίνης σε όλα τα ποντίκια NZB/W (ρ=0.77, p<0.001). Από τα ποντίκια γονείς, ένα NZB ποντίκι παρουσίασε ΕΥΝΛ ενώ όλα τα υπόλοιπα NZB και όλα τα NZW ποντίκια παρουσίασαν φυσιολογικά ευρήματα στο φωτονικό μικροσκόπιο. Εντούτοις όλα εκδήλωσαν σημαντική πρωτεϊνουρία στο 24ώρο. Τα επίπεδα ποδοσίνης ανευρέθηκαν μειωμένα στα NZB και NZW σε σύγκριση με τα NZB/W που έχουν φυσιολογική ιστολογία στο φωτονικό μικροσκόπιο (p= 0.024 , p=0.030 respectively) και εικόνα με ΗΜΝΛ (p=0.034 για NZB και NZW). Στις ανθρώπινες βιοψίες, σημαντικά περισσότεροι ασθενείς με ΔΥΝΛ παρουσίαζαν μειωμένη έκφραση νεφρίνης σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΝΛ τάξης II ή V LN (p < 0.05).
Η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη συνοπτική ανάλυση που αφορά την έκφραση της νεφρίνης και της ποδοσίνης σε πειραματόζωα και ανθρώπους με ΝΛ. Οι παραπάνω πρωτεΐνες προσδιορίζονται σε πρωτεϊνικό επίπεδο και σε επίπεδο mRNA και τα ευρήματα διασταυρώνονται με ανοσοφθορισμό στις βιοψίες. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα της νεφρίνης στο σπείραμα ήταν μειωμένα κατά σχεδόν 50% στην ήπια ΝΛ (ΗΜΝΛ) και πολύ μειωμένα σε σοβαρότερες μορφές της νόσου (ΕΥΝΛ/ΔΥΝΛ). Τα επίπεδα της ποδοσίνης είναι επηρεασμένα μόνο στις πιο σοβαρές μορφές της νόσου (ΕΥΝΛ/ΔΥΝΛ). Οι μεταβολές στη νεφρίνη και στην ποδοσίνη σχετίζονται με τη σοβαρότητα της ιστολογικής εικόνας. Τα παραπάνω ευρήματα σε συνδυασμό με τα εξίσου σημαντικά μειωμένα επίπεδα σπειραματικού mRNA των αντίστοιχων πρωτεϊνών στα μόνο πιο προχωρημένα στάδια της νόσου (ΔΥΝΛ), ίσως υποδηλώνουν ότι οι μεταβολές στις ΛΜ συμβαίνουν καταρχήν σε επίπεδο πρωτεΐνης και ακολούθως σε επίπεδο μεταγραφής της πρωτεΐνης. Οι μέχρι τώρα θεωρούμενοι φυσιολογικοί γονείς των NZBW και ιδιαιτέρως τα άρρενα ποντίκια NZW παρουσίαζαν στη μελέτη μας δομικές αλλοιώσεις των ΑΜ που σχετίζονταν με μειωμένα επίπεδα ποδοσίνης. Το εύρημα αυτό πιθανά σχετίζεται με την προδιάθεση των απογόνων τους NZB/W για νεφρική βλάβη. Βρήκαμε επίσης σημαντικά μειωμένη έκφραση νεφρίνης σε ασθενείς με τάξης IV υπερπλαστική νόσο σε σχέση με ασθενείς με τάξης V νεφρίτιδα παρά το γεγονός ότι και οι δύο έχουν συγκρίσιμα ποσά πρωτεϊνουρίας. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τα ευρήματά μας στα πειραματόζωα προτείνοντας ότι τα επίπεδα της νεφρίνης συσχετίζονται καλύτερα με την ιστολογική τάξη της νεφρίτιδας παρά με το βαθμό της πρωτεϊνουρίας. Τα ευρήματά μας υπαινίσσονται ένα νέο ρόλο των ποδοκυττάρων και των δομών τους στη σπειραματονεφρίτιδα ανοσολογικής αρχής.
|
Structure and function of glomerular epithelial cells in experimental lupus nephritis
