| Περίληψη |
Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η φασματοσκοπική μελέτη της κυτοχρωμικής οξειδάσης ba3 από το βακτήριο Thermus Thermophillus. Η οξειδάση ba3 ανήκει στην οικογένεια των χαλκοξειδασών και εμφανίζει αρκετές ομοιότητες με τα άλλα μέλη της ομάδας αλλά και ορισμένες ιδιαιτερότητες. Το ενεργό κέντρο του ενζύμου απαρτίζεται από μια αίμη τύπου α3 και ένα άτομο CuB, ενώ περιέχει και επιπλέον δύο ακόμη οξειδοαναγωγικά κέντρα: μια αίμη τύπου b και ένα διπυρηνικό κέντρο ατόμων CuA. Eκτός της ικανότητας αναγωγής του οξυγόνου προς νερό και της άντλησης πρωτονίων δια μέσου της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, έχει πρόσφατα διαπιστωθεί ότι κατέχει επιπλέον την ικανότητα αναγωγής του μονοξειδίου του αζώτου προς οξείδιο του διαζώτου, υπό αναγωγικές αναερόβιες συνθήκες. Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε κυρίως με την χρήση των τεχνικών FTIR και Time Resolved Step-Scan FTIR, με σκοπό την ταυτοποίηση τόσο των δομικών όσο και των δυναμικών χαρακτηριστικών του ενζύμου. Η φασματοσκοπία υπερύθρου αποδεικνύεται ιδιαίτερα αποτελεσματική σε αυτούς του τομείς, καθώς η υψηλή της ευαισθησία, η μεγάλη φασματική διακριτική ικανότητα αλλά και η μεγάλη χρονική ανάλυση των χρονοεξαρτώμενων πειραμάτων επιτρέπουν την ανίχνευση μεταβατικών δομικών αλλαγών ακόμη και ενός μεμονωμένου πρωτεϊνικού καταλοίπου. Η διεξαγωγή των πειραμάτων πραγματοποιήθηκε με την χρήση του σταθερού συμπλόκου του ανηγμένου ενζύμου με το μονοξείδιο του άνθρακα. Στο σύμπλοκο ισορροπίας βρέθηκε πως το 30% περίπου του δεσμευμένου CO παραμένει στον CuB, του οποίου το πρωτεϊνικό περιβάλλον εμφανίζει μεγάλη σταθερότητα στις αλλαγές pH και pD, παρατηρήσεις οι οποίες έρχονται σε συμφωνία με δημοσιευμένες μελέτες. Φωτολύοντας το σύμπλοκο ο υποκαταστάτης που αρχικά είναι δεσμευμένος στην σίδηρο της αίμης α3 μεταναστεύει μεταβατικά στον CuB , όπου παραμένει για λίγα ms. Η ανίχνευση του προϊόντος της φωτόλυσης του συμπλόκου ba3-CO σε φάσματα συνεχούς φωτόλυσης προσφέρει πληροφορίες για την δευτεροταγή δομή του ενζύμου και επιτρέπει την ταυτοποίηση δονήσεων πρωτεϊνικών ομάδων οι οποίες επηρεάζονται από την διαδικασία της φωτόλυσης. Η μελέτη της δυναμικής του ενζύμου επιτυγχάνεται μέσω των Time Resolved Step-Scan FTIR φασμάτων, τα οποία επιβεβαίωσαν την αργή κινητική του συμπεριφορά σε σχέση με άλλες οξειδάσες. Ανιχνεύοντας τις αντιδράσεις της πρωτεΐνης μετά την φωτόλυση του CO από τον αιμικό σίδηρο, προέκυψε ότι η μεταβατική δέσμευση του CO στον CuB είναι δυναμικά συζευγμένη με αλλαγές στην προπιονική ομάδα του πυρρολικού δακτυλιου Α της αίμης a3 και με αλλαγές στο τοπικό περιβάλλον των ασπαρτικών καταλοίπων D372. Σύμφωνα με την χρονική εξέλιξη των δονήσεων αυτών των ομάδων, οι οποίες συμμετέχουν σε μια από τις προτεινόμενες διαδρομές πρωτονίων διαμέσου της μεμβράνης, προκύπτει το συμπέρασμα πως η συμμετοχή των πρωτονιομένων ασπαρτικών καταλοίπων στην παρατηρούμενη αλλαγή τερματίζεται νωρίτερα από την συμμετοχή των αποπροτονιωμένων μορφών τους και των προπιονικών ομάδων. Η διαταραχή του ασπαρτικού καταλοίπου συνδέεται με τον σχηματισμό του μεταβατικού συμπλόκου και όχι με την επαναφορά του υποκαταστάτη στον σίδηρο της αίμης α3. Οι κινήσεις της πρωτεΐνης στην περιοχή των προπιονικών ομάδων και του γειτονικού Asp372 πραγματοποιούνται με τέτοιο τρόπο ώστε να μεταβάλλεται το δίκτυο τον δεσμών υδρογόνου των παραπάνω ομάδων. Με βάση τα φασματοσκοπικά δεδομένα και την συμμετοχή αυτών των ομάδων σε ένα από τα κανάλια μεταφοράς πρωτονίων, το οποίο καταλήγει σε μια περιοχή συσσώρευσης μορίων νερού, προτείνεται ένα μοντέλο για τον ρόλο του Asp372 και των προπιονικών ομάδων της αίμης α3 στην μετακίνηση πρωτονίων, στο οποίο δρουν ως ένας μοριακός διακόπτης ο οποίος ενεργοποιείται με την κοινή κατοχή ενός πρωτονίου.
|
FTIR και Time Resolved Step-Scan FTIR Μελέτη της Κυτοχρωμικής Οξειδάσης ba3 από τον οργανισμό Thermus Thermophillus
