| Περίληψη |
Οι πρωτεΐνες τύπου basic helix-loop-helix (bHLH) παίζουν αποφασιστικό ρόλο σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνεται και ο καθορισμός των νευρικών κυττάρων κατά την ανάπτυξη του Κεντρικού και Περιφερικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ και ΠΝΣ αντίστοιχα) των μεταζώων. Στη δροσόφιλα, τα πρώτα στάδια της νευρογένεσης χαρακτηρίζονται από την έκφραση των πρωτεϊνών bHLH της υποοικογένειας AS-C (Achaete-Scute Complex), η οποία περιλαμβάνει μεταγραφικούς ενεργοποιητές που έχουν την ικανότητα να ετεροδιμερίζονται με την απανταχού εκφραζόμενη πρωτεΐνη Daughterless (Da), επίσης τύπου bHLH, και να ενεργοποιούν τη μεταγραφή γονιδίων-στόχων, προσδενόμενες σε ειδικές αλληλουχίες, τα λεγόμενα στοιχεία ΕΑ. Η έκφραση των AS-C παρατηρείται αρχικά σε ομάδες κυττάρων, που καλούνται προνευρικοί συναθροισμοί. Σε μεταγενέστερα στάδια όμως η έκφρασή τους περιορίζεται σε ένα ή λίγα κύτταρα από κάθε συναθροισμό, τα οποία και διαφοροποιούνται τελικά σε νευροβλάστες. Ο περιορισμός της έκφρασης των AS-C οφείλεται στη δράση μιας ανταγωνιστικής ομάδας πρωτεϊνών bHLH, οι οποίες κωδικοποιούνται από το γονιδιακό σύμπλοκο Enhancer Of split [E(spl)-C], το οποίο περιλαμβάνει μεταγραφικούς καταστολείς τύπου bHLH, που έχουν την ικανότητα να προσδένονται ως ομοδιμερή σε ειδικές αλληλουχίες, όπως τα στοιχεία EB, EC και Ν. Οι πρωτεΐνες bHLH E(spl) ενεργοποιούνται άμεσα μεταγραφικά από το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch (N) και η έκφρασή τους έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της νευρικής τύχης στα κύτταρα των προνευρικών συναθροισμών που δέχονται το σήμα του Ν, τόσο στο ΚΝΣ όσο και στο ΠΝΣ της μύγας. Η ανταγωνιστική δράση των δύο ομάδων πρωτεϊνών έχει δειχθεί ότι βασίζεται σε διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, με τις E(spl) να στρατολογούνται στις ρυθμιστικές περιοχές τόσο των ίδιων των γονιδίων AS-C (τα οποία υπόκεινται σε θετική αυτορύθμιση), όσο και πιθανότατα άλλων νευροειδικών γονιδίων, που αποτελούν κοινούς στόχους των δύο ομάδων πρωτεϊνών, μέσω αλληλεπίδρασης με τα σύμπλοκα των ενεργοποιητών Da/AS-C, τα οποία και προσδένονται άμεσα στο DNA, χωρίς να απαιτείται έτσι άμεση πρόσδεση εκ μέρους των E(spl). Εντούτοις, η επιβεβαιωμένη ικανότητα των E(spl) να προσδένονται άμεσα στο DNA και η παρουσία συντηρημένων θέσεων πρόσδεσης για τις E(spl) στις ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων-στόχων, μας ώθησαν να διερευνήσουμε καταρχάς σε μεγαλύτερο βάθος τις τυχόν ειδικές προτιμήσεις πρόσδεσης καθεμιάς από τις επτά bHLH πρωτεΐνες του συμπλόκου E(spl), αλλά και των ετεροδιμερών που είχαν δειχθεί παλαιότερα ότι μπορούν να σχηματίζουν. Κατά δεύτερον, εξετάσαμε αν συγκεκριμένες αλληλουχίες πρόσδεσης μπορούν να επηρεάσουν τη στρατολόγηση και τη συνακόλουθη καταστολή από τις E(spl) σε φυσικούς ενισχυτές στη μύγα. Τέλος, επιχειρήσαμε να διαλευκάνουμε το ρόλο που παίζει η άμεση πρόσδεση στο DNA, σε σχέση με την έμμεση στρατολόγηση από τα σύμπλοκα των ενεργοποιητών, για τη μεταγραφική καταστολή από τις E(spl), χρησιμοποιώντας για το σκοπό αυτό κατάλληλους, τεχνητούς ενισχυτές. Επιβεβαιώσαμε έτσι αρχικά ότι οι επτά πρωτεΐνες bHLH E(spl) προσδένονται γενικά πολύ ισχυρότερα σε αλληλουχίες τύπου ΕΒ, που ήταν γνωστό ότι αποτελούν τις καλύτερες δυνατές θέσεις πρόσδεσης, σε σχέση με αλληλουχίες τύπου ΕC. Δείξαμε όμως επιπλέον ότι οι επτά πρωτεΐνες εμφανίζουν διακριτή συνάφεια πρόσδεσης, κάποιες δηλαδή προσδένονται ισχυρότερα από άλλες ως ομοδιμερή. Δείξαμε επίσης ότι συγκεκριμένα ετεροδιμερή μπορεί να έχουν ενισχυμένη ή μειωμένη συνάφεια πρόσδεσης σε σχέση με τα αντίστοιχα ομοδιμερή και υπολογίσαμε το συντελεστή διάστασης (Kd) για κάποια από τα σύμπλοκα. Η επιδραση του διμερισμού στην πρόσδεση των E(spl) φάνηκε να βασίζεται τόσο στην περιοχή HLH, όσο και στην περιοχή Orange (O), χαρακτηριστικά επίσης συντηρημένη μεταξύ των μελών της οικογένειας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η περιοχή αυτή θα πρέπει να διαμεσολαβεί στην αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα in vitro υπέδειξαν ότι τα σύμπλοκα μεταξύ των E(spl) μπορούν να προσδένονται στις ίδιες θέσεις, διαφέρει όμως η ισχύς της πρόσδεσης. Στο in vivo σύστημα, επιβεβαιώθηκε ότι η ικανότητα καταστολής εκ μέρους των E(spl) βασίζεται στη διαφορετική ικανότητα πρόσδεσής τους στα διάφορα στοιχεία τύπου ΕΒ και ΕC. Φάνηκε όμως επίσης ότι οι εκατέρωθεν του στοιχείου EB/C τρινουκλεοτιδικές αλληλουχίες, που είχαν δειχθεί παλαιότερα ότι είναι σημαντικές για την πρόσδεση των E(spl), μπορούν να επηρεάζουν αποφασιστικά την πρόσβασή τους στο DNA. Η άμεση πρόσδεση στο DNA φάνηκε τέλος να λειτουργεί σε συνδυασμό με την έμμεση στρατολόγηση από τους προσδεδεμένους στο DNA ενεργοποιητές, καθώς η μεταγραφική καταστολή από τις E(spl) ενισχύεται όταν εμπλέκονται και οι δύο μηχανισμοί. Μάλιστα, η φυσική αλληλεπίδραση των E(spl) με τις Da/AS-C έδειξε να σταθεροποιεί την καθήλωση των πρωτεϊνών στο DNA. Τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν να υποστηρίξουν ένα μοντέλο δράσης των E(spl), όπου η ικανότητά τους να επιφέρουν μεταγραφική καταστολή βασίζεται καταρχάς στη διαφορική ικανότητά τους να συγκροτούν ομο- και ετεροδιμερή με διακριτές ικανότητες πρόσδεσης στο DNA, αλλά και διακριτές ικανότητες αλληλεπίδρασης με τους ενεργοποιητές Da/AS-C, όπως ήταν ήδη γνωστό. Η πρόσβασή τους στις ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων-στόχων φαίνεται να εξαρτάται τόσο από την άμεση πρόσδεση στο DNA, όσο και από την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με τους ενεργοποιητές, με τρόπο που εξαρτάται τόσο από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες που εμπλέκονται κάθε φορά, όσο και από το είδος και τη σχετική θέση των ειδικών θέσεων πρόσδεσης για κάθε σύμπλοκο. Οι δύο μηχανισμοί μπορούν να συμβάλλουν σε μια σαφή, ακριβή μεταγραφική απόκριση, σε συνθήκες όπου χρειάζεται να ενσωματωθούν μηνύματα από διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια και η σχετική ποσότητα (και πιθανόν ενεργότητα) των ρυθμιστικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται υπόκεινται σε συνεχείς, μικρές ή μεγάλες, διακυμάνσεις.
|
In vitro και in vivo μελέτες της πρόσδεσης των πρωτεϊνών bHLH E(SPL) σε στόχους DNA
