| Περίληψη |
Τα μεταβατικά μέταλλα όπως ο σίδηρος και ο χαλκός είναι απαραίτητα για τη ζωή, ωστόσο, όταν βρίσκονται σε περίσσεια, έχουν τοξικές συνέπειες για το κύτταρο. Συνεπώς, η κυτταρική πρόσληψη και ενδοκυτταρική κατανομή τους αποτελούν διαδικασίες στενά ελεγχόμενες και ρυθμιζόμενες, με σκοπό την επίτευξη ομοιοστασίας. Οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί, από τους μύκητες μέχρι τα φυτά και τα θηλαστικά, έχουν αναπτύξει πολύπλοκους μηχανισμούς ομοιοστασίας των δύο μετάλλων, οι οποίοι παρουσιάζουν σημαντική συντήρηση. Στην παρούσα μελέτη, εξετάζουμε τον αντίστοιχο μηχανισμό ενός οργανισμού μοντέλου, του σακχαρομύκητα, στο επίπεδο της μεταγραφικής ρύθμισης, χρησιμοποιώντας τρία βασικά γονίδια αναφοράς, τα FRE1, FRE2 και CTR1. Τα δύο πρώτα κωδικοποιούν απαραίτητες για την πρόσληψη των δύο μετάλλων αναγωγάσες της πλασματικής μεμβράνης και επάγονται μεταγραφικά από την έλλειψη σιδήρου μέσω του σιδηροεξαρτώμενου ενεργοποιητή Aft1. Το FRE1 επάγεται επιπλέον από την έλλειψη χαλκού μέσω του χαλκοεξαρτώμενου ενεργοποιητή Mac1. Το CTR1 κωδικοποιεί το βασικό μεταφορέα χαλκού της πλασματικής μεμβράνης και επάγεται μεταγραφικά επίσης από την έλλειψη του μετάλλου μέσω του Mac1. Διερευνήσαμε το μηχανισμό της εξαρτώμενης από τον παράγοντα Aft1 μεταγραφικής ενεργοποίησης χρησιμοποιώντας το γονίδιο FRE2 ως βασικό μοντέλο, καθώς αυτό επάγεται αποκλειστικά και σε υψηλά επίπεδα από τον παράγοντα αυτόν. Βρήκαμε ότι οι τύπου HMG-box χρωματινικοί αρχιτεκτονικοί παράγοντες Nhp6a/b και ο μεταγραφικός συγκαταστολέας Ssn6 αποτελούν βασικούς συνενεργοποιητές της μεταγραφής του. Ο Nhp6 αλληλεπιδρά άμεσα με τον Aft1, συγκεκριμένα με το αμινοτελικό μισό του που περιλαμβάνει την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, διευκολύνοντας την πρόσδεσή του πάνω στον υποκινητή του γονιδίου. Ο Ssn6 επίσης αλληλεπιδρά άμεσα με το αμινοτελικό μισό του Aft1 και στρατολογείται στον υποκινητή FRE2 μόνο όταν οι Aft1 και Nhp6 είναι παρόντες, έχοντας βασικό και αποκλειστικά θετικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση. Ο ρόλος των Nhp6 και Ssn6 στην επαγόμενη από τον Aft1 μεταγραφή είναι ειδικός για το συγκεκριμένο υποκινητή, στον οποίο, σε συνθήκες επαγωγής, διαπιστώσαμε ότι γίνεται χρωματινική αναδιοργάνωση που εξαρτάται από τους παράγοντες αυτούς. Τα δεδομένα της παρούσας μελέτης παρέχουν την πρώτη βιοχημική ένδειξη in vivo ότι μια πρωτεΐνη τύπου HMG-box διευκολύνει την πρόσδεση στο DNA ενός ειδικού μεταγραφικού ενεργοποιητή του σακχαρομύκητα και ότι επίσης επάγει τη στρατολόγηση του Ssn6 πάνω σε έναν υποκινητή. Συνεπώς, η αποκρινόμενη στη διαθεσιμότητα σιδήρου μεταγραφική ενεργοποίηση στο σακχαρομύκητα, γίνεται μέσω πολλαπλών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του ειδικού σιδηροεξαρτώμενου παράγοντα Aft1 και γενικών μεταγραφικών συρρυθμιστών όπως οι Nhp6 και Ssn6. Διερευνήσαμε επίσης το μηχανισμό λειτουργίας του χαλκοεξαρτώμενου μεταγραφικού ενεργοποιητή Mac1. Η περιοχή ενεργοποίησης του Mac1 περιλαμβάνει δύο λειτουργικά διακριτά επαναλαμβανομενα μοτίβα κυστεϊνών, τα REPI και REPII. Έχει βρεθεί ότι το πρώτο είναι υπεύθυνο για τη χαλκοεξαρτώμενη ρύθμιση της ενεργότητας του παράγοντα. Εμείς βρήκαμε ότι το δεύτερο ρυθμίζει την ικανότητα πρόσδεσής του στο DNA. Συγκεκριμένα, δείξαμε, in vitro, ότι έχει αρνητική επίδραση στην προσδετική του ικανότητα πάνω στον υποκινητή CTR1, η οποία, in vivo, αντισταθμίζεται από το γεγονός της πρόσδεσής του ως διμερούς πάνω σε δύο διαδοχικά στοιχεία-στόχους του υποκινητή. Ο ειδικός ρόλος της περιοχής REPII υποδηλώνει ότι, in vivo, η λειτουργία του Mac1 ενδεχομένως τροποποιείται από δομικές διαμορφώσεις που επηρεάζουν τις ιδιότητες πρόσδεσής του παράγοντα στο DNA και που πιθανώς οφείλονται σε μοριακές αλληλεπιδράσεις της συγκεκριμένης περιοχής με άλλες πρωτεΐνες ή μέταλλα. Αποκαλύψαμε, τέλος, ένα νέο ρόλο του Aft1, κατασταλτικό, στη μεταγραφή του εξαρτώμενου από τον Mac1 γονιδίου CTR1, ο οποίος βασίζεται σε έμμεση στρατολόγηση και όχι άμεση πρόσδεσή του στον υποκινητή του γονιδίου. Ο ρόλος αυτός ενδεχομένως υποδηλώνει αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων Aft1 και Mac1 πάνω στο συγκεκριμένο υποκινητή. Μια τέτοια αλληλεπίδραση δεν είναι απίθανη με δεδομένη την αλληλεξάρτηση των μεταβολισμών σιδήρου και χαλκού στη ζύμη, η οποία συμβάλλει στην κυτταρική ομοιοστασία των δύο μετάλλων.
|
Μεταγραφική μελέτη της ομοιοστασίας σιδήρου και χαλκού στο μύκητα Saccharomyces cerevisiae
