| Περίληψη |
Η πρωτεΐνη p21WAF1/Cip1 (p21) παίζει σημαντικό ρόλο σε βιολογικές διεργασίες όπως η κυτταρική ανάπτυξη, η διαφοροποίηση κ.α. δρώντας ως αναστολέας του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G1 και G2. Σε συνθήκες επαγωγής της έκφρασης της p21 από εξωκυττάριους παράγοντες όπως κυτταροκίνες, γενοτοξικό στρές ή παράγοντες διαφοροποίησης, η p21 καταστέλλει την δράση των συμπλόκων που σχηματίζονται μεταξύ κυκλινών και κινασών που εξαρτώνται από τις κυκλινες (cyclin/CDKs) και την λειτουργία της πρωτεϊνης PCNA η οποία αποτελεί υπομονάδα της DNA πολυμεράσης δ με αποτέλεσμα την καταστολή της σύνθεσης του DNA κατά την φάση S και την αναστολή του κυτταρικού κύκλου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους ρυθμίζεται η έκφραση του γονιδίου p21 σε μεταγραφικό επίπεδο. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εκπονήσαμε τον λειτουργικό χαρακτηρισμό της κοντινής περιοχής του υποκινητή του γονιδίου p21 και βρήκαμε ότι δυο μέλη της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων Sp1 (Sp1 και Sp3) προσδένονται, με διαφορετική συνάφεια, σε έξι διαφορετικές θέσεις που ονομάστηκαν Sp1 θέσεις 1-6 και χαρτογραφούνται στην περιοχή του υποκινητή που περιλαμβάνεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων -120 και -45. Με μεταλλαξιογένεση των θέσεων αυτών και παροδικές επιμολύνσεις κυττάρων SL2 τα οποία στερούνται ενδογενών Sp1 παραγόντων, δείξαμε ότι οι θέσεις 1 και 2 είναι απαραίτητες για την μεταγραφική ενεργοποίηση από τους παράγοντες Sp1 και Sp3. Χρησιμοποιώντας μια μεταλλαγμένη μορφή του παράγοντα Sp1 η οποία στερείται της περιοχής ολιγομερισμού (Sp1 ΔD) δείξαμε ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου p21 επιτυγχάνεται μέσω συνεργασιακών αλληλεπιδράσεων μεταξύ Sp1 πρωτεϊνών που προσδένονται σε γειτονικές θέσεις του κοντινού υποκινητή. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής αναλύσαμε την μακρινή περιοχή του p21 υποκινητή με μεταλλαξιογέννεση και με την δημιουργία συνθετικών υποκινητών και βρήκαμε ότι η περιοχή -2,325 έως -2,280, η οποία περιλαμβάνει μια θέσης πρόσδεσης της ογκοκατασταλτικής πρωτεϊνης p53, δρα σαν μεταγραφικός ενισχυτής του γονιδίου σε κύτταρα ηπατώματος HepG2. Βρήκαμε ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου p21 από την p53 δεν μπορεί να επιτευχθεί σε κύτταρα SL2 που στερούνται ενδογενών Sp1 παραγόντων και ότι καταστέλεται από την μεταλλαξιογέννεση της Sp1 θέσης 3 στον κοντινό υποκινητή. Παράλληλα δείξαμε ότι καμία απο τις 6 θέσεις πρόσδεσης του Sp1 δεν είναι απραίτητη για την ενεργοποίηση του p21 υποκινητή από τις πρωτεϊνες Smad που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι του TGFβ. Τα παραπάνω αποτέλεσματα μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι η ενεργοποίηση του p21 υποκινητή απαιτεί λειτουργικές και φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της p53 που προσδένεται στον ενισχυτή και των παραγόντων Sp1 και Sp3 που προσδένονται στην κοντινό υποκινητή. Η άμεση πρόσδεση των Sp1 και Sp3 στην p53 αποδείχθηκε με αναλύσεις πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων τόσο σε συνθήκες in vitro όσο και in vivo. Βρήκαμε ότι οι περιοχές A, B και DBD της Sp1 αλληλεπιδρούν με την C-τερματική περιοχή 293-393 της p53 ενώ μια μεταλλαγμένη μορφή της p53 η οποία στερούνταν της ανωτέρω περιοχής δεν είχε την δυνατότητα μεταγραφικής ενεργοποίησης του p21 υποκινητή. Δείξαμε επίσης ότι οι πρωτεϊνες Sp1 και Sp3 αλληλεπιδρούν φυσικά και λειτουργικά και με την p73 η οποία είναι ομόλογη της p53 αλλά εκφράζεται σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, διερευνήσαμε την σημασία του παράγοντα Sp1 σε κυτταρικές διεργασίες που διαμεσολαβούνται από την p53 όπως το γενοτοξικό στρες. Βρήκαμε ότι η χημειοθεραπευτική ένωση 5-φθοροουρακίλη (5-FU) προκαλεί μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου p21 μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν φυσιολογική p53. H ενεργοποίηση της p53 από την 5-FU επιτελείται μέσω φωσφορυλίωσης στην σερίνη 15. Βρήκαμε επίσης ότι η ένωση Μιθραμυκίνη, η οποία χρησιμοποιείται για την θεραπεία της νόσου του Paget και ως αντικαρκινικό, έχει διπλή δράση στα κύτταρα στόχους. Από τη μια μεριά ενεργοποιεί ισχυρά την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της 5-FU δηλ. με το να προκαλεί τη φωσφορυλίωσή της στη σερίνη 15. Από την άλλη μεριά, η Μιθραμυκίνη, λόγω της ικανότητάς της να παρεμποδίζει την πρόσδεση του παράγοντα Sp1 σε πλούσια σε GC μοτίβα στους υποκινητές γονιδίων, καταστέλλει τη μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων p21 και PUMA από ενώσεις όπως η 5-FU ενώ δεν επηρεάζει τα βασικά επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων αυτών. Τέλος, βρήκαμε ότι η Μιθραμυκίνη προκαλεί ισχυρή απόπτωση στα κύτταρα HepG2 πιθανόν λόγω της ιδιότητάς της να καταστέλει την έκφραση της p21. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου p21 απαιτεί ένα σύνολο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ παραγόντων που προσδένονται στη μακρινή περιοχή και παραγόντων που προσδένονται στην κοντινή περιοχή του υποκινητή του γονιδίου. Αναστολή των αλληλεπιδράσεων αυτών δεν επιτρέπει τη βιολογική απόκριση του γονιδίου p21, με συνέπεια να παρεμποδίζεται η αναστολή του κυτταρικού κύκλου και να ευνοείται ο ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Επίσης, τα αποτελέσματά μας ενισχύουν το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 τόσο στην βασική έκφραση του γονιδίου p21 όσο και στην επαγόμενη έκφραση από κυτταροκίνες όπως ο TGFβ και χημειοθεραπευτικές ενώσεις όπως η 5-FU. Η πρωτεϊνη p21, λόγω της ικανότητάς της να αναστέλει τον κυτταρικό κύκλο, αποτελεί ένα πρώτης τάξεως εργαλείο για την καταπολέμηση νοσημάτων που χαρακτηρίζονται από ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό όπως ο καρκίνος και κατά συνέπεια η γνώση των μοριακών μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου p21 είναι πρωταρχικής σημασίας για την αντικαρκινική έρευνα.
|
Μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21 WAF1/Cip-1 του ανθρώπου
