| Περίληψη |
Το σηματοδικό μονοπάτι Notch (N) αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς μηχανισμούς διακυτταρικής επικοινωνίας και ρυθμίζει πληθώρα αναπτυξιακών διαδικασιών τόσο σε ασπόνδυλα όσο και σε σπονδυλωτά. Ανωμαλίες στη λειτουργία του σχετίζονται με μεγάλη ποικιλία αναπτυξιακών ελαττωμάτων και παθολογικών καταστάσεων, γεγονός που δείχνει την αναγκαιότητα αυστηρής ρύθμισης της μεταγωγής του σήματος. Πλήθωρα πρωτεϊνών έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί για την ικανότητά τους να ρυθμίζουν σε πολλαπλά επίπεδα τόσο τον υποδοχέα Ν όσο και τους δεσμευτές του, ενώ ένας καθοριστικός μηχανισμός ρύθμισης φαίνεται να είναι η απομάκρυνσή τους από την κυτταροπλασματική μεμβράνη και η αποικοδόμησή τους. Η ρύθμισης της συγκέντρωσης του δεσμευτή και του υποδοχέα που φτάνει στην κυτταροπλασματική μεμβράνη και ενεργοποιεί τη σηματοδότηση, αλλά και η εξασθένηση του σήματος με την απενεργοποίηση αυτών των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών φαίνεται να ρυθμίζεται μέσω της ουβικουιτινιλίωσης και της ενδοκύττωσής τους.
Δύο πρωτεΐνες που παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση των δεσμευτών Delta και Serrate είναι οι Ε3 λιγάσες ουβικουιτίνης Neuralized (Neur) και Mind Bomb(Mibl). Η ανάλυση της λειτουργίας των πρωτεϊνών αυτών τόσο στη δροσόφιλα όσο και στα σπονδυλωτά (Xenopus laevis και Danio rerio), έχει δώσει σημαντικές πληροφορίες για τον καθοριστικό ρόλο της ουβικουιτινιλίωσης στη ρύθμιση της ενδοκύττωσης και αποικοδόμησης των δεσμευτών. Η προσπάθεια κατανόησης αυτών των γεγονότων σε ολοένα μεγαλύτερη λεπτομέρεια αποκαλύπτει την πολυπλοκότητα του μηχανισμού ρύθμισης της σηματοδότησης Ν στο χρόνο και στο χώρο. Παρά το γεγονός ότι η λειτουργία της πρωτεΐνης Mibl του ποντικού φαίνεται να ρυθμίζει τη σηματοδότηση Ν, η συμμετοχή της πρωτεΐνης Neuralized-like (Neurl) σε αντίστοιχες διαδικασίες δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί.
Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής αρχικά δείξαμε την δράση του Neurl ως Ε3 λιγάση ουβικουϊτίνης και ότι αυτή εξαρτάται από τη περιοχή RING της πρωτεΐνης. Το Neurl μονο-ουβικουϊτιλιώνει ειδικά το Jagged1 in vitro, ενώ οι υπόλοιποι δεσμευτές του Notch δεν φαίνεται να αποτελούν άμεσα υποστρώματα της πρωτεΐνης. Παράλληλα, δείξαμε την δυνατότητα του Neurl να επάγει την αποικοδόμηση των Jaggedl, 2 και Dili, Dll4 μετά από ταυτόχρονη υπερέκφρασή τους σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν τις πρώτες σημαντικές πληροφορίες για τη συμμετοχή της πρωτεΐνης Neurl στη ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Ν των θηλαστικών.
Στη συνέχεια, με ανάλυση φασματοσκοπίας μάζας σε πρωτεϊνικά κλάσματα κυτταρικών σειρών μόνιμης υπερέκφρασης του Neurl, επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση του με πρωτεΐνες που προηγουμένως είχαν προσδιοριστεί με το σύστημα δύο υβριδίων του σακχαρομύκητα, ενώ ταυτοποιήσαμε επιπλέον πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις που υποδηλώνουν πιθανή μυριστοϋλίωση της πρωτεΐνης και τη συμμετοχή της σε πολλαπλές κυτταρικές διαδικασίες, όπως ακριβώς είχε προταθεί από το εργαστήριό μας σε προηγούμενες μελέτες.
Ακόμη, δείξαμε ότι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του Neurl συσχετίζονται με τη ενδοκυττάρια τοπογραφία και τη λειτουργία του. Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον το ότι τα ενδοκυττάρια επίπεδα της πρωτεΐνης φαίνεται να ρυθμίζονται μέσω ουβικουϊτινιλίωσης όπως και ότι η στόχευσή της στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, εξαρτάται από τη πιθανή μυριστοϋλίωσης της. Σημειακές μεταλλαγές που εμποδίζουν αυτές τις δύο τροποποιήσεις, φαίνεται να αναστέλλουν την ικανότητα του Neurl να επάγει την αποικοδόμηση των δεσμευτών του Ν υποδηλώνοντας πιθανή συσχέτιση της ρύθμισης της λειτουργίας της πρωτεΐνης με τη θέση της στη μεμβράνη του κυττάρου. Τέλος δείξαμε ότι η συμβολή του Neurl στην αποικοδόμηση των δεσμευτών του Ν δεν φαίνεται να απαιτεί τη μεταξύ τους άμεση αλληλεπίδραση, σε αντίθεση με την αλληλεπίδραση με το Jaggedl που είναι άμεση και απαιτεί την επανάληψη NEUZ2. Αυτό επιβεβαιώνει την πρόβλεψη ότι οι επαναλήψεις NEUZ ευθύνονται για πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και στην περίπτωση του Neurl, αναγνωρίζουν την πρωτεΐνη-στόχο για ουβικουιτινιλίωση. Από τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη Neurl του ποντικού μέσω της δράσης της ως Ε3 λιγάση ουβικουϊτίνης ρυθμίζει άμεσα ή έμμεσα την ουβικουιτινιλίωση των δεσμευτών του Notch συμμετέχοντας έτσι στο σηματοδοτικό μονοπάτι Ν.
|
Ο ρόλος της πρωτεΐνης Neuralized τουποντικού ως E3 λίγασης ουβικουιτίνης στη ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch
