Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Μελέτη Αντοχής της Coxiella burnetti στις κινολόνες  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Τίτλος Μελέτη Αντοχής της Coxiella burnetti στις κινολόνες
Συγγραφέας Spiridaki, Ioanna
Περίληψη Η παρούσα εργασία περιλαμβάνει δύο μέρη με επιμέρους ενότητες. Μέρος πρώτο: Ανίχνευση, Απομόνωση και Ταυτοποίηση στελεχών C. burnetii σε Κρήτη και Κύπρο. 1) Ανίχνευση C. burnetii σε ασθενείς με οξεία λοίμωξη πυρετού Q και ξενιστές (αιγοπρόβατα, κρότωνες) που υπεισέρχονται στην επιδημιολογική αλυσίδα της C. burnetii. Βελτιώθηκε η τεχνική της nested PCR ώστε μέσα σε 4 ώρες να έχουμε απάντηση. Η ανίχνευση της C. burnetii ήταν δυνατή σε 4 από τα 9 εξεταζόμενα δείγματα από ασθενείς, σε 5 από τα 9 δείγματα αίματος αιγοπροβάτων και σε 11 από τους 142 κρότωνες.Η μελέτη αυτή περιλαμβάνει τη πρώτη επιτυχημένη εφαρμογή της nested PCR σε φυσικά μολυσμένους κρότωνες. Η nested PCR, χρησιμοποιώντας ειδικούς για τη C. burnetii πλασμιδιακούς εναρκτές, κρίνεται αποτελεσματική τόσο στην εφαρμογή της στις επιδημιολογικές μελέτες για την αναζήτηση C. burnetii σε ξενιστές (ζώα, κρότωνες), όσο και στην εργαστηριακή διάγνωση του πυρετού Q σε ασθενείς. 2) Απομόνωση στελεχών C. burnetii. Προσαρμόστηκε τεχνική των shell vials σε Vero κύτταρα αντί σε HEL. Συνολικά απομονώθηκαν 14 στελέχη C. burnetii από τα οποία 9 προέρχονται από ασθενείς με οξεία λοίμωξη πυρετού Q (9/25, 36%), 1 από αιμόλεμφο κρότωνα (1/8, 12,5%), 2 από ολικό σώμα κρότωνα (2/142, 1,4%) και 2 από αιγοπρόβατα (2/9, 22%). Τα στελέχη αυτά είναι τα πρώτα που απομονώθηκαν σε Ελλαδικό χώρο. Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει τη πρώτη επιτυχημένη εφαρμογή της τεχνικής των shell vials σε φυσικά μολυσμένους κρότωνες. Αποδείχτηκε ιδιαίτερα χρήσιμη και αποτελεσματική στην απομόνωση στελεχών C. burnetii, τα οποία μπορούν περαιτέρω να μελετηθούν γενετικά. 3) Ταυτοποίηση των απομονωθέντων στελεχών. Η ταυτοποίηση των 14 συνολικά απομονωθέντων στελεχών C. burnetii έγινε με εφαρμογή των τεχνικών PCR-RFLP και Sequencing. Τα απομονωθέντα στελέχη C. burnetii βρέθηκαν ταυτόσημα με τα στελέχη αναφοράς Nine Mile (οξείας λοίμωξης) και Q212 (χρόνιας λοίμωξης), ανεξάρτητα από τη γεωγραφική προέλευση των δειγμάτων, τον ξενιστή και τη διαφορετική κλινική εικόνα των ασθενών με πυρετό Q. Μέρος δεύτερο: Μελέτη της ευαισθησίας και των μηχανισμών αντοχής που δυνητικά μπορεί να αναπτύξει η C. burnetii στις κινολόνες. 1) Εύρεση της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC), των απομονωθέντων στελεχών C. burnetii, στις τετρακυκλίνες, μακρολίδες και κινολόνες. Προσαρμόσαμε τη τεχνική των shell vials και του άμεσου ανοσοφθορισμού σε Vero κύτταρα. Την μικρότερη MIC την παρουσίασαν στα αντιβιοτικά doxycycline, ofloxacin και trovafloxacin (από 1-2μg/ml). Λιγότερο δραστικά αποδείχθηκαν η pefloxacin (από 1-4μg/ml) και η clarithromycin (από 2-4μg/ml). Η ciprofloxacin ήταν το αντιβιοτικό με την μικρότερη δραστικότητα (από 4-8μg/ml). Η in vitro δράση της trovafloxacin, μια καινούργια κινολόνη, μελετήθηκε για πρώτη φορά. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας, επαληθεύουν την βακτηριοστατική δράση των παραπάνω αντιβιοτικών, εξηγούν την θεραπευτική αποτυχία των χρόνιων λοιμόξεων πυρετού Q και προτείνουν τη χορήγηση της trovafloxacin εναλλακτικά στη θεραπεία του οξέος πυρετού Q. 2)Διερεύνηση μηχανισμών αντοχής που δυνητικά μπορεί να αναπτύξει η C. burnetii στις κινολόνες (gyrA, Uptake). Α) Παρασκευή ανθεκτικών στελεχών C. burnetii στη pefloxacin. Κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης δεν βρέθηκαν φυσικά στελέχη C. burnetii με αντοχή στις κινολόνες. Προκειμένου να μελετηθεί η αντοχή που δυνητικά μπορεί να αναπτύξει η C. burnetii στις κινολόνες, δύο από τα απομονωθέντα ευαίσθητα στελέχη (MICs 1-4μg/ml)μετατράπηκαν, in vitro, σε ανθεκτικά στη pefloxacin (MICs 32-64μg/ml). Η μετατροπή έγινε μετά από καλλιέργεια τους σε διαδοχικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού στο θρεπτικό υλικό. Β). Μελέτη της περιοχής QRDR του γονιδίου gyrA της C. burnetii. Χρησιμοποιώντας τη τεχνική PCR έγινε ανίχνευση της περιοχής QRDR του γονιδίου gyrA της C. burnetii στα ευαίσθητα (MIC </4 μg/ml) και στα in vitro ανθεκτικά στελέχη (MIC >8 μg/ml). Μετά από εφαρμογή της μεθόδου sequencing στα προιόντα της PCR, βρέθηκε μια σημειακή μετάλλαξη στα ανθεκτικά στελέχη, που αντιστοιχεί στη θέση 87 των αμινοξέων της πρωτείνης GyrA. Στην συνέχεια αναπτύχθηκαν οι τεχνικές PCR-RFLP για την ανίχνευση της μετάλλαξης αυτής, κατευθείαν σε κλινικά δείγματα, με απώτερο στόχο τον ορθότερο θεραπευτικό χειρισμό του πυρετού Q. Γ). Μελέτη των πρωτεινών της εξωτερικής μεμβράνης. Χρησιμοποιώντας τη τεχνική Renographin Gradient Centrifugation έγινε καθαρισμός των βακτηρίων C. burnetii από το κύτταρο ξενιστή. Ακολούθησε απομόνωση της εξωτερικής μεμβράνης ευαίσθητων (MIC </4 μg/ml) και in vitro ανθεκτικών στελεχών C. burnetii (MIC >8 μg/ml). Οι μεμβρανικές πρωτείνες εξετάσθηκαν χρησιμοποιώντας τη τεχνική του SDS-PAGE. Δεν υπήρξαν διαφορές ανάμεσα στα ευαίσθητα και τα in vitro ανθεκτικά στελέχη C. burnetii. Δ). Μελέτη πρόσληψης της pefloxacin (Uptake). Μελετήθηκε η ενδοκυττάρια συγκέντρωση της pefloxacin τροποποιώντας τη μέθοδο του Chapman και Georgopapadakou, ώστε να μπορεί να εφαρμοστεί σε βακτηριακά κύτταρα αλλά και σε Vero κύτταρα μολυσμένα με C. burnetii. Τα πειράματα εφαρμόστηκαν σε ευαίσθητα (MIC </4 μg/ml) και in vitro ανθεκτικά στις κινολόνες στελέχη C. burnetii (MIC >8 μg/ml) (βακτήρια, μολυσμένα κύτταρα). Μετρήθηκε ο ενδοκυττάριος φθορισμός της pefloxacin, μετά από διάρρηξη των κυττάρων, σε τακτά χρονικά διαστήματα. Τα ευαίσθητα στελέχη συγκεντρώνουν μεγαλύτερη ενδοκυττάρια ποσότητα αντιβιοτικού απ'ότι τα ανθεκτικά. Η διαφορά αυτή είναι στατιστικά σημαντική (P<0.05). Η πρόσληψη της pefloxacin δεν μεταβάλλεται παρουσία της CCCP. Ε). Μελέτη παραγόντων που πιθανόν να επηρεάζουν την ενδοκυττάρια συγκέντρωση της pefloxacin. 1. Θερμοκρασία. Πειράματα πρόσληψης της pefloxacin, στους 25 και 370C έδειξαν ότι η θερμοκρασία δεν επηρεάζει την ενδοκυττάρια συγκέντρωση του αντιβιοτικού. 2. pH. Εξετάστηκε η πρόσληψη της pefloxacin σε δύο διαφορετικά pH (4.5, 7.2). Βρέθηκε ότι το όξινο pH επηρεάζει αρνητικά την ενδοκυττάρια συγκέντρωση της pefloxacin. Η διαφορά αυτή είναι στατιστικά σημαντική (P<0.05). Συμπέρασμα: Η C. burnetii δεν αναπτύσει μηχανισμό αντοχής από αδιαβατότητα, λόγω μετάλλαξης των πορινών, ούτε από ενεργό εκροή του αντιβιοτικού. Η ελαττωμένη ενδοκυττάρια συγκέντρωση της pefloxacin, πιθανόν να οφείλεται σε ελαττωμένη πρόσληψη του αντιβιοτικού στο όξινο περιβάλλον των φαγολυσοσωμάτων, λόγω ελάττωσης της διαμέτρου των πορινών. Ανθεκτικά στελέχη C. burnetii, έναντι των κινολονών, μπορούν να δημιουργηθούν μετά από μετάλλαξη στη περιοχή QRDR του γονιδίου gyrA της C. burnetii. Για τον λόγο αυτό, οι κινολόνες δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται στη κλινική πράξη για τη θεραπεία του χρόνιου πυρετού Q.
Γλώσσα Ελληνικά
Ημερομηνία έκδοσης 2001-01-01
Ημερομηνία διάθεσης 2001-02-06
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 45

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 7