| Περίληψη |
Το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ (Τ3SS, Type three secretion system), είναι ένας εξειδικευμένος μοριακός μηχανισμός, ο οποίος καθιστά ικανά πολλά Gram-αρνητικά βακτήρια να εκκρίνουν και να διοχετεύουν τοξικές πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα του ευκαρυωτικού ξενιστή τους. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το μονοπάτι έκκρισης κωδικοποιείται από τα γονίδια hrp (HR και pathogenicity) και hrc (HR και conserved).
H παρούσα εργασία ασχολείται με τη δομική μελέτη τη πρωτεΐνης HrpA, η οποία είναι μια μικρή υδροφιλική πρωτεΐνη του Τ3SS της P. syringae pv. phaseolicola. H HrpA είναι η κύρια δομική πρωτεΐνη του αγωγού (pilus) του Τ3SS, του οποίου η δομή μοιάζει με τις γνωστές βελονοειδείς δομές (needle) των ζωοπαθογόνων βακτηρίων, ενώ η διάμετρος του υπολογίζεται περίπου στα 6 έως 8 nm και το μήκος μέχρι 2 μm. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΗrpA αγρίου τύπου, υπερεκφράστηκε και απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε φυσικοχημική και δομική μελέτη της πρωτεΐνης, μεταβάλλοντας διάφορες παραμέτρους (pH, συγκέντρωση, χρόνο ανάπτυξης, θερμοκρασία) με μεθόδους κυκλικού διχρωισμού (CD), φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), φασματοσκοπίας Raman (Raman spectroscopy), και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης υψηλής ανάλυσης (high resolution TEM).
Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε δομικός και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός του μεταλλάγματος HrpAΔC8 σε διάφορες συνθήκες με χρωματογραφία μοριακής διήθησης, CD, σκέδαση ακτίνων Χ σε μικρές γωνίες (SAXS) και high resolution TEM
Τέλος, ακολουθήθηκε πρωτόκολλο απομόνωσης του αγωγού του T3SS (pilus) από την P. syringae pv. phaseolicola, με σκοπό να μελετηθούν οι δομικές του ιδιότητες με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης υψηλής ανάλυσης (HRTEM) και να συγκριθούν με τις πολυμερικές ιδιότητες που έχει η ανασυνδυασμένη HrpA να σχηματίζει ινώδεις δομές με χαρακτηριστικές διαστάσεις που κυμαίνονται από την μάκρο- στην μίκρο- κλίμακα. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο υψηλής διακριτικής ικανότητας, η πρωτεΐνη αυτό-οργανώνεται in vitro, σχηματίζοντας ινίδια με διαστάσεις που μοιάζουν σημαντικά με τα δομικά χαρακτηριστικά του αγωγού του T3SS της P. syringae pv. phaseolicola.
Συμπερασματικά, ενώ η HrpA προβλέπεται σαν α-ελικοειδής πρωτεΐνη, το φάσμα κυκλικού διχρωισμού της, παρουσιάζει χαμηλά ποσοστά α-έλικας ενώ μοιάζει πολύ με το φάσμα των αποδιπλωμένων πρωτεϊνών. Τα πειράματα φασματοσκοπίας RAMAN, FTIR και SAXS που πραγματοποιήθηκαν, επιβεβαιώνουν τις παρατηρήσεις από το CD.
|
Δομικός και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός της πρωτεϊνης HrpA του βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ
