| Περίληψη |
Εισαγωγή
Η αναγνώριση του ρόλου των μεσεγχυματικών στρωματικά κύτταρα (MSC) στην αιματοποίηση, ως μέρος
του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών, ανανέωσε το ενδιαφέρον για την ex vivo έκπτυξη του
αίματος ομφάλιου λώρου (CB) ως πηγής HSC για μεταμόσχευση. Τα MSC από παιδιά φαίνεται να έχουν
διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες σε σχέση με αυτά από τους ενήλικες. Το αίμα του ομφάλιου λώρου είναι
πλούσια πηγή αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, των οποίων ο χαρακτηρισμός και η απομόνωση
απαιτεί ειδικούς δείκτες - ως τέτοιοι αναφέρονται το αντιγόνο επιφανείας CD34 και στη συνέχεια το
αντίστοιχο CD133 - καθώς και αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα πρωτόκολλα.
Στην παρούσα εργασία αρχικά αξιολογήθηκε η ικανότητα απομόνωσης CD133+ κυττάρων από CB και
μελετήθηκε ο ρόλος της αλληλεπίδρασης των MSC μυελού των οστών παιδιών με αρχέγονα αιμοποιητικά
κύτταρα (CB και BM) στην ex vivo έκπτυξη τους.
Μεθοδολογία
Ο διαχωρισμός των CD34+ κυττάρων έγινε με ανοσομαγνητική μέθοδο ενώ ο διαχωρισμός των CD133+
με την ίδια μεθοδολογία παρουσίασε μη επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων και δοκιμάστηκε βελτίωση
με διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις.
MSC κύτταρα απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν από μυελό οστών παιδιών και ο χαρακτηρισμός τους
περιελάμβανε ανάπτυξη αποικιών CFU-F και διαφοροποίηση σε οστεο-, λιπο-, χονδρο-κύτταρα κάτω
από κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας.
Στη συγκαλλιέργεια αρχέγονων CD34+ και MSC προστέθηκαν οι συνδυασμοί αυξητικών παραγόντων: α)
GF1: SCF, Intereukin-3 (IL-3), G-CSF, GM-CSF και β) GF2: SCF, θρομβοποιητίνη (TPO), Intereukin-6
(IL-6), Flt-3 ligand, παράγοντες που θεωρούνται ότι επιδρούν σε πιο άωρους πληθυσμούς. Η
ταυτοποίηση των κυτταρικών υποπληθυσμών έγινε με ανοσοφαινοτυπική ανάλυση των αντιγόνων
επιφανείας που χαρακτηρίζουν τα αιμοποιητικά και τα μεσεγχυματικά κύτταρα.
Η εκτίμηση της κλωνογονικής ικανότητας των εκπτυχθέντων αιμοποιητικών πληθυσμών
πραγματοποιήθηκε με την ανάπτυξη αποικιών CFU-GM σε καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης.
Έγινε ποσοτική μέτρηση των επιπέδων του SDF-1 και της Ang-1 στο υπερκείμενο των καλλιεργειών με
ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) και τα δείγματα cDNA ελέγχθηκαν
με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τα γονίδια Oct-4, Sox2, και Nanog.
Αποτελέσματα
Δείχτηκε ότι δεν είναι εφικτός αξιόπιστος και υψηλής απόδοσης διαχωρισμός CD133+ κυττάρων από αίμα
ΟΛ με την προτεινόμενη μεθοδολογία, και η εφαρμογή τροποποιημένου πρωτόκολλου δεν απέφερε
επαρκή, αμιγή πληθυσμό για τη μελέτη συγκαλλιέργειας CD133+ με MSC. Γι' αυτό η περαιτέρω έρευνα
επικεντρώθηκε στον CD34+ κυτταρικό πληθυσμό.
Χαρακτηρισμός MSC από μυελό οστών (BM). Τα MSC εμφάνισαν στην πρώτη και διατήρησαν στις
επόμενες επανακαλλιέργειες το χαρακτηριστικό ατρακτοειδές σχήμα και τους αντίστοιχους δείκτες
επιφανείας.
Ανάπτυξη CFU-F αποικιών: Τα MSC στο κλάσμα των μονοπύρηνων ανέπτυξαν 5.68±0.9 αποικίες. Στην
Ρ1 το σύνολο των αποικιών CFU-F ήταν 38.75±4.77 και μειώνονταν με τη πρόοδο της καλλιέργειας.
Διαχωρισμός CD34 και CD133 HSC. Η απομόνωση του CD34+ πληθυσμού με την ανοσομαγνητική
μέθοδο, απέδωσε πληθυσμό υψηλής καθαρότητας (93.0±1.06%). Για το διαχωρισμό των CD133+
κυττάρων η έκφραση CD133 κυμάνθηκε από 10-85% (median 60%).
Ex vivo έκπτυξη CD34+ κυττάρων και του ολικού πληθυσμού HSC κυττάρων. Η παρουσία των MSC και
του συνδυασμού αυξητικών παραγόντων απέδωσε την υψηλότερη έκπτυξη τόσο του συνολικού αριθμού
των κυττάρων όσο και του CD34+ πληθυσμού. Οι δύο διαφορετικοί συνδυασμοί GF φαίνεται ότι ασκούν
παρόμοια επίδραση στην έκπτυξη των CD34+, ενώ η παρουσία μόνο των MSC στη καλλιέργεια των
CD34+ αύξησε τον αριθμό τους κατά 1.58±0.59 και 2.07±0.78 φορές για το CB και το BM αντίστοιχα.
Ωστόσο, αυτή η συνθήκη παρουσίασε το χαμηλότερο βαθμό έκπτυξης των CD34+ σε σύγκριση με εκείνη
όπου χρησιμοποιήθηκαν αυξητικοί παράγοντες. Σύγκριση CB-CD34 με τα αντίστοιχα του BM, έδειξε
μεγαλύτερη ικανότητα έκπτυξης των πρώτων όσον αφορά τον ολικό αριθμό των κυττάρων αλλά και τον
CD34+ πληθυσμό.
Ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά των υποπληθυσμών των εκπτυγμένων αιμοποιητικών κυττάρων. Το
ποσοστό των CD34+ κυττάρων ήταν υψηλότερο απουσία αυξητικών παραγόντων, ανεξάρτητα από την
προέλευση των HSC. Η διατήρηση των χαρακτηριστικών αωρότητας υποστηρίχθηκε περαιτέρω από τους
κυτταρικούς υποπληθυσμούς CD34+38- και CD34+33-, των οποίων η έκφραση ήταν υψηλότερη στην
κατάσταση όπου τα αιμοποιητικά κύτταρα αναπτύχθηκαν παρουσία μόνο MSC κυττάρων.
Μελέτη ανάπτυξης αποικιών μυελικής σειράς (CFU-GM). Παρά το γεγονός ότι η παρουσία μόνο MSC
στην καλλιέργεια δεν αυξάνει ιδιαίτερα τον αριθμό των CD34+ κυττάρων, ο πληθυσμός στο τέλος της
συγκαλλιέργειας φαίνεται να χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη κλωνογονικότητα.
Έκφραση Oct-4, Sox2 και Nanog. Τα MSC παρουσίασαν τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης Oct-4,
Sox2 .Το Nanog εκφράζεται σε όλες τις συνθήκες που μελετήθηκαν.
Αξιολόγηση επιπέδων SDF-1 και Ang-1( ELISA). Τόσο ο SDF1a όσο και η Angio-1 εκφράζονται ιδιαίτερα
στο υπερκείμενο παρουσία των MSC που φαίνεται να είναι και η κύρια πηγή προέλευσής τους. Πολύ
υψηλότερη έκφραση SDF1a παρατηρήθηκε στην συγκαλλιέργεια με MSC, όταν BM-CD34 κύτταρα
προστίθενται είτε μόνα, ή με αυξητικούς παράγοντες και αυτή ήταν υψηλότερη σε σύγκριση με την
αντίστοιχη κατάσταση όπου CB-CD34 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν στη συγκαλλιέργεια με MSC.
Συζήτηση
Η συγκαλλιέργεια των CB-HSC παρουσία αλλογενών MSC έχει ως αποτέλεσμα την έκπτυξη ενός πιο
αρχέγονου πληθυσμού, εάν συγκριθεί με την αντίστοιχη έκπτυξη παρουσία αυξητικών παραγόντων.
Επίσης η συγκαλλιέργεια των CB-HSC με MSC και GF παρέχει όχι μόνο αύξηση του πληθυσμού των
κυττάρων CD34+, αλλά και του ολικού κυτταρικού πληθυσμού. Στην αυτόλογη συνθήκη όπου BM-CD34
συγκαλλιεργήθηκαν με τα αντίστοιχα MSC η παρουσία των αυξητικών παραγόντων ήταν πιο
αποτελεσματική στην έκπτυξη του ολικού αριθμού των εμπύρηνων κυττάρων (TNC). Ως εκ τούτου, η
προσθήκη MSC, φαίνεται σαν μια ελκυστική εναλλακτική λύση για τη βελτίωση της έκπτυξης των
προγονικών κυττάρων. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ του συνδυασμού αυξητικών παραγόντων
πρώιμης και όψιμης δράσης, ενδεικτικό πιο περίπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ των διαφόρων
παραγόντων η οποία σίγουρα, δεν περιορίζεται σε ένα μικρό αριθμό κυτοκινών και αυξητικών
παραγόντων.
Τα MSC διατηρούν τους πληθυσμούς με αυξημένη κλωνογονικότητα, όπως φαίνεται από την ανάπτυξη
μεγαλύτερου αριθμού CFU-GM αποικιών. Η παρουσία των αυξητικών παραγόντων μάλλον οδηγεί σε πιο
διαφοροποιημένα κύτταρα αφού είχαμε μικρότερο αριθμό CFU-GM όταν προστέθηκαν στη
συγκαλλιέργεια. Τα CB-CD34+ κύτταρα όταν συγκαλλιεργήθηκαν με MSC απέδωσαν περισσότερες
αποικίες από τα αντίστοιχα BM-CD34+.
Γνωρίζοντας ότι τα Oct4, Sox2, Nanog εμπλέκονται στη διαδικασία της αυτο-ανανέωσης και της
πολυδυναμικότητας των αρχέγονων κυττάρων εξετάστηκε η έκφραση τους σε ορισμένες από τις
πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιήσαμε, προκειμένου να αξιολογηθεί, μεταξύ άλλων
χαρακτηριστικών της πολυδυναμικότητας, εάν επηρεάζονται τα γονίδια αυτά. Δεν παρατηρήθηκε
τροποποίηση των επιπέδων έκφρασης οποιουδήποτε από τους τρεις παράγοντες μεταγραφής.
Ο SDF-1α προτείνεται μεταξύ των παραγόντων που παίζουν κρίσιμο ρόλο στην καθυστερημένη
εγκατάσταση του μοσχεύματος (engraftment) που παρατηρείται στη μεταμόσχευση CB. Στα
αποτελέσματα μας παρατηρήθηκε διαφορά στα επίπεδα SDF-1α μεταξύ CB κ BM, και οι καλλιέργειες
μυελού των οστών εξέφραζαν υψηλότερα επίπεδα της χημειοκίνης σε σύγκριση με αυτές που
προέρχονταν από κύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος υποδεικνύοντας πιθανή ερμηνεία της αργής
εγκατάστασης του μοσχεύματος που παρατηρείται στη CB μεταμόσχευση. Επιπλέον τα επίπεδα του
SDF-1α ήταν υψηλότερα όπου MSC ήταν παρόντα και αυτό δεν άλλαξε ούτε με την παρουσία των CD34+
ή/και με εκείνη των GF, υποδηλώνοντας συμβολή των μεσεγχυματικών κυττάρων που προέρχονται από
μυελό των οστών παιδιών στην διατήρηση των υψηλότερων επιπέδων του SDF-1α, που σε συνδυασμό
με GF θα μπορούσε να ενισχύσει την μετανάστευση, επιβίωση και έκπτυξη των αιμοποιητικών κυττάρων
στη μεταμόσχευση.
Η Ang-1 που συμβάλλει άμεσα στην ομοιόσταση των HSC μέσω της αλληλεπίδρασης της με τον
υποδοχέα Tie-2 που εκφράζεται από τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα στη μελέτη μας, δεν παρουσίασε
διαφορά των επίπεδων της στα υπερκείμενα της συγκαλλιέργειας μεταξύ των κυττάρων που
προέρχονταν από CB και αυτών που προέρχονταν από BM. Επίσης δεν υπήρχε διακύμανση στα
επίπεδα που ανιχνεύθηκαν στις διάφορες συνθήκες παρουσία των MSC στην καλλιέργεια.
Χρησιμοποιήσαμε κύτταρα BM ως μοντέλο της ex vivo έκπτυξης αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και
αυτόλογων MSC έτσι ώστε να έχουμε μια άμεση σύγκριση με τα CB αποτελέσματα. Η ex-νίνο έκπτυξη
αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών έχει περιορισμένα χρησιμοποιηθεί για κλινικούς σκοπούς
αφού συνήθως είναι ικανή η επάρκεια του. Παρατηρήσαμε ότι η έκπτυξη των CB-CD34 δίνει παρόμοια
αποτελέσματα με τα BM-CD34 κύτταρα στη συνθήκη όπου μόνο κύτταρα στρώματος είναι παρόντα ενώ
καμιά πρόσθετη επίδραση δεν παρατηρήθηκε στα BM-CD34 με την παρουσία αυξητικών παραγόντων.
Συμπερασματικά τα CB-CD34 φαίνεται να είναι καταλληλότερα για την ex-vivo έκπτυξη αρχέγονων
αιμοποιητικών κυττάρων από εκείνα που προέρχονται είτε από ενήλικα είτε από κύτταρα μυελού των
οστών παιδιών, γεγονός που μπορεί να σχετίζεται με βιολογικές ιδιότητες των κυττάρων
ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Εντούτοις η ποικιλία συνθηκών έκπτυξης που αναφέρεται στη
βιβλιογραφία υπογραμμίζει την ανάγκη για περισσότερο τυποποιημένα πρωτόκολλα, ενώ παράλληλα,
τονίζει την πολυπλοκότητα της βιολογίας, ακόμη και σε ένα περιορισμένο ex vivo σύστημα όπου
πιθανώς αποσαφηνίζεται μόνο ένα πολύ μικρό μέρος της.
|
Αλληλεπίδραση μεσεγχυματικών κυττάρων (κυττάρων στρώματος) με υποπληθυσμούς αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων
