| Περίληψη |
Επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει μια αντιστρόφως
ανάλογη συσχέτιση μεταξύ των επίπεδων της HDL χοληστερόλης και του κινδύνου
εμφάνισης στεφανιαίας νόσου στον άνθρωπο. Κύριο πρωτεϊνικό συστατικό των
λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) αποτελεί η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι, η οποία
και κατέχει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση, τη δομή, καθώς και τη λειτουργία της
HDL. Η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι δρα προστατευτικά ως προς την εμφάνιση
καρδιαγγειακών νοσημάτων μέσω των αλληλεπιδράσεων της με άλλες πρωτεΐνες που
συμμετέχουν ενεργά στο μεταβολισμό της HDL.
Πρόσφατες έρευνες υποστηρίζουν πως η φυσιολογικά αθηροπροστατευτική
HDL μπορεί να μετατραπεί σε αθηροματωγόνο ως αποτέλεσμα των οξειδωτικών
τροποποιήσεων που υφίσταται η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι από το ένζυμο
μυελοπεροξειδάση. Οι τροποποιήσεις αυτές αφορούν σε συγκεκριμένα αμινοξικά
κατάλοιπα της πρωτεΐνης μεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται τα κατάλοιπα
μεθειονίνης και τυροσίνης στις θέσεις 148 και 192, αντίστοιχα. Για τη μελέτη των
μηχανισμών δράσης της μυελοπεροξειδάσης που διαταράσσουν τη φυσιολογική
λειτουργία της HDL, δημιουργήθηκαν ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί που εκφράζουν τις
μεταλλαγμένες μορφές apoΑ-Ι(Met148Ala) και apoΑ-Ι(Tyr192Ala). Για το σκοπό
αυτό, αρχικά δημιουργήθηκαν στο γονίδιο της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι με τη μέθοδο
του overlapping PCR οι παραπάνω μεταλλάξεις, Met148Ala και Tyr192Ala. Στη
συνέχεια, οι apoA-I(Met148Ala) και apoA-I(Tyr192Ala) αλληλουχίες που
προέκυψαν, κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο παλινδρομικό φορέα και οι αντίστοιχοι
ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί παράχθηκαν με τη μέθοδο AdEasy. Μελλοντικά,
πρόκειται να μελετηθούν οι ιδιότητες αυτών των αδενοϊών τόσο in vitro όσο και in
vivo με μεταφορά γονιδίων μέσω αδενοϊών σε επίμυες με έλλειψη apoΑ-Ι (apoΑΙ-/-).
Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί ταυτόχρονη μόλυνση επίμυων με αδενοϊούς που
εκφράζουν οποιαδήποτε από τα δύο μεταλλάγματα της αποΑ-Ι μαζί με αδενοϊό που
εκφράζει τη μυελοπεροξειδάση, με σκοπό να αξιολογηθεί in vivo η επίδραση του
ενζύμου αυτού στα επίπεδα των λιπιδίων του πλάσματος, το σχήμα και το μέγεθος
της HDL.
Το δεύτερο μέρος της παρούσας μελέτης αφορά στη μελέτη της επίδρασης δύο
φυσικά απαντώμενων μεταλλάξεων της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι, των
apoA-I(Leu141Arg)Pisa και apoA-I(Leu159Arg)Finland στο μεταβολισμό της HDL.
Ετεροζυγώτες για οποιαδήποτε από τις δύο παραπάνω μεταλλάξεις παρουσιάζουν
πολύ χαμηλά επίπεδα HDL χοληστερόλης στο πλάσμα λόγω της μειωμένης
ικανότητας ενεργοποίησης της LCAT. Προηγούμενες μελέτες με πειράματα
μεταφοράς γονιδίων μέσω αδενοϊών σε επίμυες με έλλειψη αποΑ-Ι φανερώνουν ότι
και οι δύο μεταλλάξεις αδυνατούν να σχηματίσουν είτε δισκοειδή είτε σφαιρικά HDL
σωματίδια, και ότι χορήγηση του ενζύμου LCAT μπορεί να διορθώσει τον
παθολογικό φαινότυπο της HDL που παρατηρείται. Για την περαιτέρω μελέτη των
ιδιοτήτων των συγκεκριμένων δομικών αλλαγών της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι in vivo,
δημιούργηθηκαν διαγονιδιακοί επίμυες που φέρουν τις παραπάνω μεταλλάξεις. Για
το σκοπό αυτό, η αγρίου τύπου ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Α-Ι, καθώς και οι
apo(Leu141Arg) και apoA-I(Leu159Arg) κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα
κλωνοποίησης σε κατιούσα θέση σε σχέση με τον TTR1 υποκινητή, ο οποίος
χρησιμοποιήθηκε για την ιστοειδική έκφραση του εκάστοτε διαγονιδίου στο ήπαρ.
Στη συνέχεια ακολούθησε απομόνωση των TTR1-apoA-I τμημάτων από τις
κατασκευές, τα οποία και χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση των ενέσεων
κατά τη διαδικασία δημιουργίας των διαγονιδιακών ζώων. Η γονοτύπηση των ζώων
πραγματοποιήθηκε με τις μεθόδους της PCR και της ανοσοτύπωσης κατά Southern.
Μελλοντικά, ένας ιδρυτής από κάθε διαγονιδιακή σειρά πρόκειται να επιλεγεί έτσι
ώστε τα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης των τριών διαγονιδίων να είναι παρόμοια.
Έπειτα τα ζώα αυτά θα διασταυρωθούν με επίμυες με έλλειψη apoΑ-Ι για τη
δημιουργία διαγονιδιακών επίμυων που θα εκφράζουν μόνο την αντίστοιχη, είτε
αγρίου τύπου είτε μεταλλαγμένη, ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Α-Ι. Στα ζώα που θα
προκύψουν θα θα μελετηθεί η επίδραση της κάθε μετάλλαξης στην ικανότητα
αλληλεπίδρασης της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι με άλλους παράγοντες του HDL
μονοπατιού, καθώς και στην ομοιόσταση των λιποπρωτεϊνών στο πλάσμα. Η
δημιουργία των apoA-I(Leu141Arg)Pisa και apoA-I(Leu159Arg)Finland διαγονιδιακών
επίμυων καθιστά δυνατή τη μακροπρόθεσμη και εις βάθος μελέτη του παθολογικού
φαινότυπου των συγκεκριμένων μεταλλάξεων. Τέλος, μπορεί να συνεισφέρει
σημαντικά στη διαλεύκανση της αιτιολογίας των γενετικής προέλευσης χαμηλών
επιπέδων HDL στο πλάσμα, προσφέροντας με αυτόν τον τρόπο νέα προοπτική στη
διάγνωση, την πρόγνωση και τη θεραπεία.
|
Δημιουργία αδενοϊών και διαγονιδιακών ποντικιών που φέρουν μεταλλαγμένες μορφές της απολιποπρωτεϊνης Α-Ι για τη μελέτη των επιπτώσεών τους στο μεταβολισμό της HDL in vivo
