| Περίληψη |
Η Γη αποτελείται από ποικίλα φυσικά περιβάλλοντα, τα οποία χαρακτηρίζονται στην πλειοψηφία
τους από ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Παρά αυτό το γεγονός, αναρίθμητοι οργανισμοί έχουν
βρεθεί να αποικίζουν και να ευδοκιμούν σε αυτά τα σκληρά και αφιλόξενα περιβάλλοντα. Μεταξύ
αυτών, οι πιο διαδεδομένοι, ονομάζονται ψυχρόφιλοι, καθώς έχουν προσαρμοστεί για επιβίωση σε
πολύ χαμηλές θερμοκρασίες. Αυτοί οι ψυχρόφιλοι οργανισμοί παρουσιάζουν ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό
ενδιαφέρον, το οποίο επικεντρώνεται τα ένζυμα που κωδικοποιούν. Τέτοιου είδους προσαρμοσμένα
στο κρύο ένζυμα χαρακτηρίζονται από υψηλότερη καταλυτική ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες
και μικρότερη θερμική σταθερότητα συγκριτικά με ομόλογα τους από μεσόφιλους οργανισμούς.
Τέτοιου είδους χαρακτηριστικά θεωρούνται ως πλεονέκτημα σε ποικίλες βιοτεχνολογικές εφαρμογές.
Σε προηγούμενη ερευνητική εργασία του εργαστηρίου MINOTECH biotechnology, μια βακτηριακή
συλλογή αποτελούμενη από 262 στελέχη, τα οποία συλλέχθηκαν από θαλάσσια ύδατα στην
Ανταρκτική, ελέγχθηκαν για την έκφραση ενεργότητας αλκαλικής φωσφατάσης. Εννέα από αυτά τα
στελέχη επιλέχθηκαν για αλληλούχιση του γονιδιώματος τους, καθώς παρουσίασαν υψηλή ενεργότητα
αλκαλικής φωσφατάσης αλλά και μείωση αυτής έπειτα από θερμική επεξεργασία. Το γονίδιο APT110α
από το στέλεχος TAP110α επιλέχθηκε και μετέπειτα απομονώθηκε, βάση της μεγάλης ομολογίας της
αλληλουχίας του και της συντήρησης των καταλοίπων του ενεργού κέντρου συγκριτικά με άλλες
χαρακτηρισμένες αλκαλικές φωσφατάσες. Το γονίδιο αυτό, κλωνοποιήθηκε σε κύτταρα Ε. coli
προκειμένου να επαληθευτεί η ενεργότητα αλκαλικής φωσφατάσης.
Στην παρούσα εργασία, η παραπάνω έρευνα συνεχίστηκε, με σκοπό τον βιοχημικό και βιοφυσικό
χαρακτηρισμό της TAP110α αλκαλικής φωσφατάσης, αλλά και τον ανασχεδιασμό των ιδιοτήτων της
μέσω εισαγωγής στοχευμένων μεταλλαγών στην αλληλουχία της. Αναλυτικότερα, παρουσιάζεται ένα
ολοκληρωμένο πρωτόκολλο καθαρισμού για την απομόνωση της TAP110α αλκαλικής φωσφατάσης.
Επιπροσθέτως, υπολογίστηκαν οι κινητικές παράμετροι του ενζύμου, ενώ η πρωτεΐνη κρυσταλλώθηκε
επιτυχώς και δεδομένα περίθλασης από την ακτινοβόληση τους συλλέχθηκαν, με απώτερο σκοπό την
ανάλυση της τριτοταγούς δομής του ενζύμου. Η τεχνική της φασματομετρίας κυκλικού διχρωισμού
χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της θερμικής σταθερότητας αλλά και της δευτεροταγούς δομής του
ενζύμου. Τέλος, με βάση τα αρχικά αποτελέσματα από τον χαρακτηρισμό της TAP110α αλκαλικής
φωσφατάσης, σχεδιάστηκαν αμινοξικές μεταλλαγές με σκοπό την αύξηση της καταλυτικής ενεργότητας
του ενζύμου αλλά και την μείωση της θερμικής σταθερότητας του.
Με βάση τα αποτελέσματα από τα παραπάνω πειράματα, η TAP110α αλκαλική φωσφατάση
παρουσιάζει αξιοσημείωτη θερμική σταθερότητα συγκριτικά με ομόλογα ψυχρόφιλα ένζυμα.
Επιπροσθέτως, οι μεταλλαγές D179H και D179E έδειξαν ότι οδηγούν σε θερμική αστάθεια του ενζύμου,
με την μεταλλαγή D179E να αυξάνει και την ενεργότητα του ενζύμου. Ο χαρακτηρισμός και των άλλων
σχεδιασμένων μεταλλαγών ίσως να οδηγήσει σε περαιτέρω βελτίωση του ενζύμου. Τέλος, η
αποσαφήνιση της τρισδιάστατης δομής του ενζύμου θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την
διερεύνηση των μηχανισμών θερμικής προσαρμογής του ενζύμου, αλλά και για τον σχηματισμό
περισσότερων κατευθυνόμενων μεταλλαγών.
|
Characterization and putative biotechnological applications of a psychrophilic alkaline phosphatase from the bacterial strain TAB110a
