| Περίληψη |
Η ευπάθεια των φυτών στο παγετό συχνά οφείλεται στην παρουσία παγοπυρηνωτικών βακτηρίων και μυκήτων. Οι μικροοργανισμοί αυτοί προκαλούν πάγωμα στα φυτά εξαιτίας κάποιων πρωτεϊνών που παράγουν. Το φαινόμενο είναι γνωστό σαν βιολογική παγοπυρήνωση και αποτελεί αντικείμενο έρευνας για πάνω από 25 χρόνια. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μέρος μίας ερευνητικής προσπάθειας με απώτερο στόχο τον προσδιορισμό των παραγόντων που σχετίζονται με το φαινόμενο της βιολογικής παγοπυρήνωσης σε ευκαρυωτικά συστήματα και την αξιοποίησή του στη βιοτεχνολογία και την γενετική βελτίωση φυτών για αντοχή σε παγετούς. Στο πρώτο μέρος αυτής της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν διαγονιδικά φυτά καπνού μετασχηματισμένα με το παγοπυρηνωτικό γονίδιο inaZ του βακτηρίου Pseudomonas syringae. Το πρώτο μέρος αυτής της μελέτης αναφέρεται στην ανάπτυξη της αναγκαίας μεθοδολογίας για τον έλεγχο μεγάλου αριθμού ετερόζυγων (inaZ +/-) φυτών και την επιλογή εκείνων των φυτών που εξαιτίας ακτινοβόλησής τους με ακτίνες γ, επιβιώνουν μετά από έκθεση σε θερμοκρασίες παγετού. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε για επιλογή ανθεκτικών φυτών περιελάμβανε δύο δοκιμές παγώματος. Η πρώτη μαζική παραγωγή έγινε σε στάδιο σποροφύτων, ενώ η δεύτερη έγινε σε δισκία φύλλου από τα επιλεγμένα φυτά της πρώτης δοκιμής. Και οι δύο δοκιμές παγώματος έγιναν σε μικροτριβλία που επέπλεαν στην επιφάνεια ψυχόμενου αλκοολόλουτρου σε θερμοκρασίες υπό το °C. Απομονώθηκαν έτσι φυτά καπνού με αυξημένη αντοχή σε υπό το μηδέν θερμοκρασίες. Το δεύτερο μέρος αυτής της μελέτης αφορά την απομόνωση ενός παγοπυρηνωτικού cDNA κλώνου από τον μύκητα F. acuminatum. Για τον σκοπό αυτό κατασκευάσθηκαν δύο cDNA βιβλιοθήκες σε φορέα λZAP II, που διέφεραν ως προς το μέσο μέγεθος των ενθέτων τους. Το παγοπυρηνωτικό cDNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό ετερόλογης υβριδοποίησης και μίας νέας λειτουργικής δοκιμής. Η δοκιμή αυτή είναι απλή και γρήγορη και μπορεί να χρησιμοποιηθεί και στην απομόνωση και άλλων παγοπυρηνωτικών γονιδίων. Βασίζεται στην επαγομένη έκφραση cDNA των κλώνων της βιβλιοθήκης και την ¨λειτουργική σάρωση¨ α) πλακών φάγων, μετά από μεταφορά των πρωτεϊνών τους σε φίλτρα μεμβρανών και β) αποικιών βακτηρίων μετά από in vivo εκτομή φαγεμιδίων. Η απομόνωση του παγοπυρηνωτικού cDNA κλώνου επιβεβαιώθηκε με μετασχηματισμό βακτηρίων και με έλεγχο της παγοπυρηνωτικής δράσης τους. Η παγοπυρηνωτική δράση του απομονωμένου κλώνου συγκρίθηκε με αυτή του γονιδίου inaZ και με την αντίστοιχη υγρής καλλιέργειας του μύκητα από τον οποίο απομονώθηκε. Ακολούθησε αλληλούχιση του παγοπυρηνωτικού cDNA κλώνου και in silico ανάλυση της προβλεπόμενης δομής της παγοπρωτεΐνης που κωδικοποιεί, σύμφωνα με την οποία στο μόριο της παγοπρωτεΐνης δεν υπάρχουν οι συντηρημένες επαναλήψεις αμινοξικών αλληλουχιών που χαρακτηρίζουν της βακτηριακές παγοπρωτεΐνες, αν και υπάρχουν ορισμένες ατελείς αμινοξικές επαναλήψεις. Η προβλεπόμενη δομή της παγοπρωτεΐνης έχει τμηματική ομολογία με γλυκοϋδρολάσες και περιέχει αντιπαγοτικά μοτίβα σε διαφορετικά τμήματα του μορίου.
|
Συμβολή στη μελέτη της ευκαρυωτικής παγοπυρήνωσης. Ανάπτυξη μεθόδου επιλογής φυτών καπνού (Nicotiana tabacum L.) Ανθεκτικών στο πάγωμα και απομόνωση παγοπυρηνωτικού γονιδίου από τον μύκητα Fusarium acumitatum.
