| Περίληψη |
Το πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας αναφέρεται στο χαρακτηρισμό μια νέας πρωτεΐνης, που απομονώθηκε από βολβούς του οργανισμού Charybdis maritimα, και ονομάστηκε χαρυβδίνη. Το ενδιαφέρον για το συγκεκριμένο οργανισμό οφείλεται στο γεγονός ότι περιέχει ένα αρκετά μεγάλο αριθμό ενώσεων με σημαντικές φαρμακευτικές ιδιότητες. Η χαρυβδίνη απομονώθηκε σε καθαρή μορφή και παρήχθησαν κρύσταλλοι οι οποίοι και έδωσαν δεδομένα περίθλασης σε διακριτικότητα 1,6Å. Τα δεδομένα περίθλασης αναλύθηκαν για τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών της δομή της, ενώ προσδιορίστηκε επίσης η αλληλουχία DNA καθώς και η αμινοξική αλληλουχία. Η σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων της χαρυβδίνης με αλληλουχίες μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών έδειξε ότι η χαρυβδίνη είναι μέλος μια σημαντικής οικογένειας πρωτεϊνών οι οποίες αναστέλλουν μη αντιστρεπτά τη δράση των ριβοσωμάτων (Ribosome Inactivating Proteins - RIP). Η χαρυβδίνη αποτελείται από μια ενιαία πολύπεπτιδική αλυσίδα με μοριακό βάρος περίπου 29 kDa, η οποία (μέσω ενός μηχανισμού απογλυκοζιλίωσης) αναστέλλει την πρωτεϊνική μετάφραση σε διαλυμένα δίκτυο-ερυθροκύτταρα με IC50 24nM. Χαρακτηριστικό της χαρυβδίνης είναι η διαφοροποίηση εξαιτίας μετάλλαξης, ενός εκ των τεσσάρων αμινοξέων που σχηματίζουν το ενεργό της κέντρο. Συγκεκριμένα, στη θέση 79 του ενεργού κέντρου μια βαλίνη έχει αντικαταστήσει το κατά τα άλλα συντηρημένο, μεταξύ 360 πρωτεϊνών RIP, κατάλοιπο τυροσίνης. Το δεύτερο μέρος της εργασίας αναφέρεται στην ανάπτυξη ενός αμπερομετρικού αισθητήρα για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων, χρησιμοποιώντας φωτοσυνθετικό υλικό ακινητοποιημένο σε ηλεκτρόδια μεταξοτυπίας. Η ακινητοποίηση πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο της μοριακής διασύνδεσης παρουσία BSA και γλουταραλδεΰδης. Η αρχή ανίχνευσης ζιζανιοκτόνου βασίζεται στην παρεμπόδιση της ηλεκτρονιακής ροής στο φωτοσύστημα ΙΙ εξαιτίας της παρουσίας του ζιζανιοκτόνου, το οποίο εμποδίζει τη φωτοσυνθετική διαδικασία μειώνοντας τη αναγωγή του μεταφορέα ηλεκτρονίων με συνέπεια την μείωση του επαγόμενου ρεύματος. Η διαδικασία της φωτοσύνθεσης ελέγχεται μέσω της ποσότητας του ανηγμένου τεχνητού μεταφορέα ηλεκτρονίων, ο οποίος παράγεται κατά τον φωτισμό του φωτοσυνθετικού υλικού. Η οξείδωση του παραπάνω μεταφορέα στο ηλεκτρόδιο παράγει και το καταγραφόμενο σήμα, συσχετίζοντας έτσι την ένταση του ρεύματος με τη συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου. Το συγκεκριμένο σύστημα, χρησιμοποιώντας θυλακοειδείς μεμβράνες, έχει χρόνο ζωής έως και 23 ώρες και επιτρέπει την ανίχνευση των φωτοσυνθετικών ζιζανιοκτόνων με όριο ανίχνευσης της τάξεως των 10-300nM, αναλόγως με τον τύπο ζιζανιοκτόνου. Προκαταρτικές αναλύσεις δειγματοληψιών ύδατος ποταμού έδειξαν καλό συσχετισμό μεταξύ των αποτελεσμάτων που λήφθηκαν με χρωματογραφία-GC και τη χρήση του παραπάνω βιοαισθητήρα. Παράλληλα μελετήθηκε η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων Chlamydomonas, όπου και παρατηρήθηκε αύξηση του χρόνου ζωής σε 42 ώρες και μείωση του ορίου ανίχνευσης των φωτοσυνθετικών ζιζανιοκτόνων στα 20-8nM, ανάλογα με τον τύπο ζιζανιοκτόνου.
|
Απομόνωση, χαρακτηρισμός και κρυσταλλική δομή της χαρυβδίνης, μιας νέας πρωτεΐνης, από τον οργανισμό Charybdis maritima. Aνάπτυξη βιοαισθητήρα που βασίζεται σε φωτοσύστημα για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων
