| Περίληψη |
Η πεπτιδογλυκάνη αποτελεί απαραίτητο συστατικό του βακτηριακού
κυτταρικού τοιχώματος. Συγκεκριμένα, είναι ένα μακρομόριο από μακριές
αλυσίδες εναλλασσόμενων μονάδων σακχάρων Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης- Ν
και ακετυλομουραμικού οξέος συνδεδεμένων μέσω β-1,4-Ν- γλυκοζιτικών
δεσμών. Υπόκειται σε τροποποιήσεις της δομής της, με πιο χαρακτηριστική
την N-απακετυλίωση της πεπτιδογλυκάνης από τις απακετυλάσες της Νακετυγλυκοζαμίνης, η οποία επηρεάζει την αναγνώριση του βακτηρίου από τα
κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή. Οι απακετυλάσες της
Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης ανήκουν στην οικογένεια 4 των εστερασών
υδατανθράκων (CE4), η οποία περιλαμβάνει τις απακετυλάσες της Νακετυλογλυκοζαμίνης της πεπτιδογλυκάνης, τις απακετυλάσες των
χιτοολιγοσακχαριτών της NodB των ριζόβιων , τις απακετυλάσες χιτίνης, τις
εστεράσες ακετυλοξυλάνης, και τις ξυλανάσες A, C, D και Ε. Τα μέλη αυτής
της οικογένειας εμφανίζουν σημαντική ομολογία μεταξύ τους και
περιλαμβάνουν εκτός από την πολύ καλά συντηρημένη επικράτεια ομολογίας
NodB, μια συντηρημένη τριάδα αμινοξικών καταλοίπων δέσμευσης μετάλλου
(Asp, His, His), ένα συντηρημένο καταλυτικό κατάλοιπο Asp στο ενεργό
κέντρο, και μια συντηρημένη υδροξυλιωμένη Pro στο άτομο Cα (2-Hyp), που
εντοπίζονται στην επικράτεια NodB. Το γονιδίωμα του B. cereus κωδικοποιεί
6 απακετυλάσες της πεπτιδογλυκάνης, τρείς εκ των οποίων έχουν ήδη
μελετηθεί (BC1960, BC3618, BC1974). Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται
στην απακετυλάση πεπτιδογλυκάνης BC1960. Πραγματοποιήθηκε μεταλλαγή
του καταλοίπου Arg169 σε Ala με σκοπό την απόκτηση περισσοτέρων
πληροφοριών για τον μηχανισμό υδροξυλίωσης του Cα της Pro171. Από τους
13 αρχικούς κλώνους που προέκυψαν επιλέχτηκε ο 13ος ως κατάλληλος για
περεταίρω μελέτη. Αρχικά, εξετάστηκαν οι συνθήκες έκφρασης και επαγωγής
της πρωτεΐνης. Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη υπερεκφράστηκε σε BL21 DE3
κύτταρα και απομονώθηκε με τη χρήση μεταλλοχηλικής χρωματογραφίας
συγγένειας (Ni-NTA agarose). Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα
κυκλικού διχρωϊσμού. Σύμφωνα με αυτά η πρωτεΐνη είναι αρκετά
θερμοσταθερή καθώς διατηρεί τα στοιχεία δευτεροταγούς διαμόρφωσης και
στις θερμοκρασίες των 60oC. Επίσης, είναι α-ελικοειδής σε μεγάλο βαθμό
καθώς εμφανίζει τα χαρακτηριστικά ελάχιστα στα 208nm και στα 222nm και
το ανάλογο μέγιστο στα 195nm. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με
την ανάλυση ιδιοτιμών ή SVD. Τέλος, οι κρυσταλλώσεις που δοκιμάστηκαν
έδωσαν θετικά αποτελέσματα, ενώ παράλληλα πραγματοποιήθηκαν πειράματα
συν-κρυσταλλώσεων και crystal soaking χρησιμοποιώντας 3 διαφορετικούς
ligands.
|
Δομική και βιοχημική μελέτη του ενεργού κέντρου της απακετυλάσης της πεπτιδογλυκάνης BC1960
