Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Δημιουργία φυτών Nicotiana benthamiana με πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων με την χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000407882
Τίτλος Δημιουργία φυτών Nicotiana benthamiana με πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων με την χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9
Άλλος τίτλος Production of DCL knock-out Nicotiana benthamiana plants using CRISPR/Cas9 system
Συγγραφέας Μήττα, Ελένη Σ.
Σύμβουλος διατριβής Καλαντίδης, Κρίτων
Μέλος κριτικής επιτροπής Τσαγρή, Ευθυμία
Βόντας, Ιωάννης
Περίληψη Η RNA σίγηση (RNA silencing ή RNA interference, RNAi) περιγράφει την εμπλοκή μορίων RNA σε μηχανισμούς γονιδιακής ρύθμισης που οδηγούν στη παρεμπόδιση της έκφρασης ή της μετάφρασης των γονιδίων-στόχων. Κύριο χαρακτηριστικό όλων αυτών των μοριακών μονοπατιών είναι η παραγωγή μικρών μορίων RNAs (miRNAs και siRNAs), μεγέθους 20-24 νουκλεοτιδίων, από τις Dicer-like (DCL) πρωτεΐνες. Στη Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) έχουν βρεθεί τέσσερις DCL πρωτεΐνες, κάθε μια από τις οποίες παράγει μικρά μόρια RNAs συγκεκριμένου μεγέθους που έχουν συγκεκριμένη λειτουργία. Το ενδιαφέρον για την μελέτη της λειτουργίας αυτών των πρωτεϊνών, σε συνδυασμό με την ανάπτυξη της τεχνικής CRISPR/Cas9 ως εργαλείο για την πλήρη καταστολή γονιδίων, μας ώθησαν στην χρήση της τεχνικής CRISPR/Cas9 με σκοπό την πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων. Ένα λειτουργικό σύστημα CRISPR/Cas9, αποτελείται από ένα μόριο RNA (sgRNA), ομόλογο με την προς στόχευση αλληλουχία DNA και από μια ενδονουκλεάση Cas9, η οποία οδηγείται από το sgRNA στην αλληλουχία στόχο, δημιουργώντας δίκλωνα ρήγματα στο συγκεκριμένο σημείο του γονιδιώματος. Έτσι αποκτήθηκε πλασμίδιο που περιέχει το γονίδιο της Cas9 και σχεδιάστηκαν νέα πλασμίδια που φέρουν μια αλληλουχία υπεύθυνη για την έκφραση sgRNA που στοχεύουν τα προς καταστολή γονίδια (DCL2, DCL3 ή DCL4) σε συγκεκριμένες περιοχές. Τα πλασμίδια αυτά αρχικά χρησιμοποιήθηκαν για την παροδική έκφραση του συστήματος (έλεγχος λειτουργικότητας του συστήματος CRISPR/Cas9, με παροδική έκφραση των επιμέρους στοιχειών του) και στη συνέχεια, για τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών που υπερεκφράζουν τα sgRNA ή την Cas9. Μετά από την διασταύρωση των παραπάνω φυτικών σειρών και την απόκτηση φυτών που εκφράζουν την Cas9 και κάποιο sgRNA που στοχεύει ένα από τα προς μελέτη γονίδια ακολούθησε η ανίχνευση και ταυτοποίηση των προκληθέντων μεταλλάξεων στα φυτά C1 και C2 γενιάς. Από τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης φαίνεται ότι επιτεύχθηκε η απόκτηση φυτών με γενετικές τροποποιήσεις στα γονίδια των DCL2 και DCL3, ενώ η ανάλυση για το DCL4 γονίδιο δεν ολοκληρώθηκε. Η εργασία θα ολοκληρωθεί με την πραγματοποίηση δοκιμών λειτουργικότητας των πρωτεϊνών για να εξακριβωθεί με ακρίβεια η καταστολή τους. Όλα τα φυτά πλήρους καταστολής των DCL πρωτεϊνών θα πρέπει μελλοντικά να συγκριθούν με φυτά που παρουσιάζουν μερική καταστολή για τις πρωτεΐνες αυτές μέσω RNAi (DCLi φυτικές σειρές). Έτσι, μελετήθηκε στις DCLi φυτικές σειρές (και σε φυτά που προκύπτουν από την διασταύρωση τους), η παραγωγή μικρών RNA κατά την παροδική έκφραση ενός μεταγράφου GFP με δομή φουρκέτας (hairpin), καθώς επίσης, μελετήθηκε και η διαφορά μολυσματικότητας δυο RNA ιών (CMVGR21 και TRV-GFP). Αυτά τα πειράματα θα λειτουργήσουν ως πρότυπο σύγκρισης για τα φυτά με πλήρη καταστολή των DCL πρωτεϊνών που βρίσκονται σε διαδικασία δημιουργίας. Συνοψίζοντας, σε αυτή την εργασία, περιγράφουμε τη μέθοδο για την απόκτηση φυτών με στοχευμένη μετάλλαξη σε επιθυμητά γονίδια. Αυτά τα φυτά θα είναι ένα εξαιρετικό εργαλείο για την μελέτη διαφόρων βιολογικών λειτουργιών, όπως ο ρόλος των DCL πρωτεϊνών σε περιπτώσεις ιικών μολύνσεων ή υπερέκφρασης πρωτεϊνών.
Φυσική περιγραφή 118 φύλλα : σχεδ., πιν., εικ. (μερ. έγχ.) ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα RNA silencing
RNA σίγηση
Ημερομηνία έκδοσης 2017-03-17
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
  Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
Εμφανίσεις 61

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 5