|
|
| Identifier |
000352751 |
| Title |
Λειτουργικός χαρακτηρισμός πρωτεινών του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ του φυτοπαθογόνου βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola |
| Alternative Title |
Functional characterization of type III secretion proteins of the phytopathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola |
|
Author
|
Μπαστάκη, Μαρίνα
|
|
Thesis advisor
|
Πανόπουλος, Ν.
Κοκκινίδης, Μ
|
| Abstract |
Το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ (Type III secretion system, TTSS) απαντάται σε Gram- βακτήρια και ευθύνεται για την έκκριση ή/και μεταφορά πρωτεϊνών απευθείας από το βακτηριακό στο ευκαρυωτικό κυτταρόπλασμα. Το ΤΤSS είναι μια πρωτεϊνική υπερδομή που δομείται από 20-25 πρωτεΐνες και εδράζεται στο βακτηριακό κυτταρικό φάκελο. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το ΤΤSS σχετίζεται με την παθογένεια και κωδικοποιείται από τη γονιδιακή νησίδα hrp/hrc. Το φυτοπαθογόνο βακτήριο Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Psph) χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο στην παρούσα διατριβή για το δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό επιμέρους συστατικών της εκκριτικής συσκευής. Το οπερόνιο avrPphF της Psph κωδικεύει ένα ζεύγος σαπερόνης/συγγενούς πρωτεΐνης-τελεστή (AvrPphF_ORF1/ORF2) του TTSS. Το σύμπλοκο ORF1-ORF2 ανιχνεύτηκε in vivo τόσο στο σακχαρομύκητα, χρησιμοποιώντας το σύστημα των δύο υβριδίων, όσο και μετά από συνέκφραση και συγκαθαρισμό από την Escherichia coli. Οι δύο πρωτεΐνες φαίνεται να συμμετέχουν στο συγκαθαριζόμενο σύμπλοκο με αναλογία 2ORF1:1ORF2, όπως άλλα σύμπλοκα σαπερόνης/υποστρώματος των TTSS. Η περιοχή πρόσδεσης της AvrPphF_ORF1 εντοπίζεται στα 55 αμινοτελικά κατάλοιπα της AvrPphF_ORF2, ενώ η περιοχή 42-55 aa φαίνεται να είναι κρίσιμη για την αλληλεπίδραση των δύο μορίων. Η πρωτεΐνη HrcQΒ ανήκει στο συντηρημένο πυρήνα της εκκριτικής συσκευής και η καρβοξυτελική της περιοχή (HrcQΒ-C, κατάλοιπα 50-128) σχηματίζει σταθερά τετραμερή σύμπλοκα σε κρυστάλλους, σε αντίθεση με την ομόλογή της (FliN) από τη Thermotoga maritima η οποία σχηματίζει ομοδιμερή. Για να διερευνηθεί αν η βιολογικά ενεργή μονάδα της HrcQΒ-C είναι το τετραμερές ή μικρότερης ή και μεγαλύτερης τάξης σύμπλοκα, κατασκευάστηκαν τέσσερα στοχευμένα μεταλλάγματα της πρωτεΐνης και διερευνήθηκε η ολιγομερική τους κατάσταση σε διάλυμα. Τα τρία από αυτά, σχηματίζουν ομοτετραμερή της ίδιας υδροδυναμικής ακτίνας με τη φυσικού τύπου πρωτεΐνη αλλά με πιο ετερογενή μοριακό πληθυσμό και διαφοροποιημένη θερμοσταθερότητα. Η στοχευμένη εισαγωγή καταλοίπων τρυπτοφάνης στη HrcQΒ-C, η οποία στερείται αρωματικών καταλοίπων, επέτρεψε τη συλλογή φασμάτων κυκλικού διχρωισμού στο εγγύς υπεριώδες που στηρίζουν την υπόθεση ότι η τριτοταγής διευθέτησή της σε διάλυμα προσομοιάζει εκείνη της κρυσταλλικής δομής. Η πρωτεΐνη ΗrpΕ, που δεν κατατάσσεται στην ομάδα των συντηρημένων συστατικών του TTSS, αλλά φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό και συντηρημένο λειτουργικό ρόλο στο μηχανισμό της έκκρισης, ιδιο-συνδέεται in vivo και in vitro και αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες HrpO και HrcN. Η κατασκευή ελλειμμάτων της πρωτεΐνης HrpE επέτρεψε τη σκιαγράφηση ενός πιθανού πρότυπου ολιγομερισμού της σε διάλυμα και τον εντοπισμό επιμέρους περιοχών της που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις αυτές. Επιπλέον, η υποκυτταρική θέση της HrpE και η επίδρασή της στην ενεργότητα ΑΤΡάσης της HrcN, σε συνδυασμό με δεδομένα από μελέτες σε μαστιγιακά και μη TTSS οδήγησαν σε ένα υποθετικό μοντέλο που σκιαγραφεί το ρόλο των αλληλεπιδράσεων αυτών στο μηχανισμό λειτουργίας της εκκριτικής συσκευής.
|
| Language |
Greek |
| Subject |
Circular dichroism |
|
Gel Filtration chromatography |
|
Protein-protein interactions |
|
Αλληλεπιδράσεις πρωτεινών |
|
Κυκλικός Διχρωισμός |
|
Συστήματα δύο υβριδιών |
|
Χρωματογραφία μοριακής διήθησης |
|
Ψευδομονάδα |
| Issue date |
2009-11-26 |
| Collection
|
School/Department--School of Sciences and Engineering--Department of Biology--Doctoral theses
|
|
|
Type of Work--Doctoral theses
|
| Views |
249 |
Λειτουργικός χαρακτηρισμός πρωτεινών του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ του φυτοπαθογόνου βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
