| Περίληψη |
Ο ρόλος των miRNA στη ρύθμιση των βιολογικών διεργασιών στα ζώα φαίνεται να
είναι πολύ σημαντικός. Η αρνητική ρύθμιση που ασκούν στην έκφραση ποικίλων
γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τα κάνει απαραίτητα για
την κανονική ανάπτυξη των κυττάρων. Η διαταραχή της έκφρασης των miRNA σε
διάφορους ιστούς είναι στενά συνδεδεμένη με εμφάνιση καρκίνου. Περισσότερα από
τα μισά γνωστά miRNA βρίσκονται μέσα σε Cancer-associated genomic
regions(CAGR), περιοχές επιρρεπείς σε μεταβολές όπως διαγραφές, μετατοπίσεις,
μεταλλαγές, ενισχύσεις του γονιδιώματος και παρουσιάζουν φαινότυπο καρκίνου. Αν
ένα miRNA που υπο κανονικές συνθήκες ρυθμίζει αρνητικά ένα ογκογονίδιο και
βρίσκεται σε CAGR, σε μία περιοχή που είναι διαγραμμένη, τότε η ογκοπρωτείνη θα
εκφράζεται ανεξέλεγκτα και το miRNA παίρνει χαρακτήρα ογκοκαταστολέα.[1] Μέσα
από μια προηγούμενη δουλειά, χρησιμοποιώντας υπολογιστικές μεθόδους (in silico),
γίνανε προβλέψεις σε CAGRs, όπου ανακαλύφθηκαν καινούρια δυνητικά miRNA.
Βρέθηκαν τέσσερις περιοχές που εκφράζουν δυνητικά miRNA οι οποίες εκφράζονται
σε HeLa κύτταρα και σχετίζονται με διαφορετικούς καρκίνους.[2] Ένα από αυτά (cmiR-
Ch9) είχε τα καλύτερα χαρακτηριστικά ενός αληθινού miRNA, του οποίου η
γονιδιωματική περιοχή, εικάζεται να είναι διαγραμμένη σε μεγάλο ποσοστό ασθενών
καρκίνου ουροδόχου κύστης.[3] Χρησιμοποιώντας γνωστά υπολογιστικά εργαλεία
πρόβλεψης καθώς και ένα μη δημοσιευμένο εργαλείο που σχεδιάστηκε από
προηγούμενη δουλεία, το Targetprofiler, έγινε έρευνα για πιθανούς στόχους μου
μπορεί να έχει το c-miR-Ch9. Τα in silico αποτελέσματα δείχνουν οτι το c-miR-Ch9
στοχεύει το CCND2[4] γονίδιο που εκφράζει τη Cyclin D2 πρωτεΐνη απαραίτητη για
τη μετάβαση της G1 φάσης σε S φάση στον κυτταρικό κύκλο. Τα χαρακτηρίστικα
αυτού του γονιδίου μας αφήνει να υποθέτουμε ότι μπορεί να είναι ένα ογκογονίδιο και
το c-miR-Ch9 να έχει χαρακτήρα ογκοκατασταλτικό. Στη συνέχεια, για την
επιβεβαίωση στόχευσης του CCND2 3΄UTR από c-miR-Ch9 διεξάχθηκαν μετρήσεις
λουσιφεράσης σε HeLa κύτταρα. Για τη διεκπεραίωσή τους πραγματοποιήθηκαν δυο
κλωνοποιήσεις σε φορέα λουσιφεράσης. Η πρώτη κλωνοποίηση έφερε ένα κομμάτι
του 3΄UTR σε αγρίου τύπου μορφή εκατέρωθεν του γονιδίου της λουσιφεράσης. Η
δεύτερη κατασκεύη έφερε το ίδιο κομμάτι του 3΄UTR στο οποίο όμως
πραγματοποιήθηκαν μεταλλαγές στην θέση στόχο του c-miR-Ch9. Οι δύο κατασκευές
καθώς και δύο κλωνοποιήσεις που έγιναν από προηγούμενη δουλειά οι οποίες έφεραν
τη θέση στόχο εις τριπλούν σε αγρίου τύπου και μεταλλαγμένη μορφή αντίστοιχα,
μετασχηματίστηκαν σε HeLa κύτταρα με σκοπό την μέτρηση του γονιδίου αναφορας.
Για θετικό control χρησιμοποιήθηκε anti-c-mir-Ch9-LNA το οποίο υβριδοποιείται με
το c-miR-Ch9 και καταστέλλει τη δέσμευση του στη θέση στόχο. Η πειραματική
διαδικασία έδειξε, όχι μόνο ότι το πρωταρχικό μικρό RNA μόριο που εμφανίστηκε στο
northern blot[2]είναι πραγματικό miRNA αλλά και ότι το συγκεκριμένο miRNA
στοχεύει το CCND2. Λέξεις κλειδία: miRNΑ-καρκίνος, CCND2,in-vitro ανάλυση
3΄UTR, Luciferase assays, υπολογιστικά προγράμματα πρόβλεψης πιθανών στόχων
miRNA, Targetprofiler,καρκίνος ουροδόχου κύστης
|
In silico και in vitro στοιχεία δείχνουν ότι το CCND2 3΄UTR στοχεύεται από ένα νέο miRNA
