| Περίληψη |
Τα Νευροστεροειδή Διϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA), Θειϊκή Διϋδροεπιανδροστερόνη (DHEAS) και Αλλοπρεγνανολόνη (Allopregnanolone, Allo) παράγονται από το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ) και τον φλοιό των Επινεφριδίων, και τα επίπεδά τους μειώνονται σταδιακά πρωϊούσης της ηλικίας. Η μείωση αυτή έχει συσχετισθεί με δυσλειτουργία και εκφύλιση του Νευρικού Ιστού, πιθανόν διότι αυτά τα στεροειδή δρουν προστατευτικά στα νευρικά κύτταρα έναντι πολλών τοξικών παραγόντων. Πράγματι, πειραματικά δεδομένα αναφέρουν πως τα στεροειδή αυτά προστατεύουν νευρώνες του ιπποκάμπου και του φλοιού από βλάβες λόγω ισχαιμικών επισοδίων ή υπερδιεγερσιμότητας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε την προστατευτική δράση των τριών αυτών στεροειδών στον μυελό των επινεφριδίων, ένα σημαντικό τμήμα του Συμπαθητικού Νευρικού Συστήματος, και παρακείμενο ιστό της κύριας θέσης παραγωγής αυτών των στεροειδών στην περιφέρεια, τον φλοιό των επινεφριδίων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πως τα Νευροστεροειδή DHEA, DHEAS και Allo ασκούν αντι-αποπτωτική δράση στην επαγώμενη από στέρηση ορού/αυξητικών παραγόντων απόπτωση στα νευρογενούς προέλευσης χρωμιόφιλα κύτταρα επίμυος, αλλά και στην κυτταρική σειρά PC12, ένα καταξιωμένο μοντέλο μελέτης της κυτταρικής απόπτωσης κι επιβίωσης των νευρικών κυττάρων. Οι δράσεις των Νευροστεροειδών είναι χρόνο-και δόσο-εξαρτώμενες, με EC50 της τάξης του 1.8, 1.1 και 1.5 nM για τις DHEA, DHEAS και Allo αντίστοιχα. Η προ-επιβιωτική δράση τους φαίνεται ότι είναι ανεξάρτητη των NMDA, GABAA, Σίγμα-1 κι οιστρογονικών υποδοχέων κι εξαρτάται από τις αντι-αποπτωτικές πρωτεϊνες Bcl-2 διότι antisense ολιγονουκλεοτίδια κατά των πρωτεϊνών αυτών, ανέστειλλαν πλήρως τις αντι-αποπτωτικές δράσεις τους. Τα Νευροστεροειδή αυτά επίσης ενεργοποιούν τους προ-επιβιωτικούς μεταγραφικούς παράγοντες CREB και NF-κΒ, οι οποίοι αποτελούν ρυθμιστές της έκφρασης των γονιδίων Bcl-2. Επιπλέον, ενεργοποιούν την αντι-αποπτωτική κινάση PKCα/β, ένα μετα-μεταφραστικό ενεργοποιητή των πρωτεϊνών Bcl-2 και τέλος, επάγουν την φωσφορυλίωση-ενεργοποίηση δύο κύριων προ-επιβιωτικών μονοπατιών κινασών, τα PI3Κ-Akt και Src-MEK-ERK μονοπάτια. Δεδομένης της ανατομικής εγγύτητας της δικτυωτής ζώνης του φλοιού και του μυελού των επινεφριδίων, ελέγχθηκε επίσης η πιθανή παρακρινική δράση των Νευροστεροειδών στην παραγωγή και έκλυση των Κατεχολαμινών από τα συμπαθητικοαδρενεργικά κύτταρα χρησιμοποιώντας το μοντέλο των κυττάρων PC12. Οι DHEA, DHEAS και Allo αύξησαν ταχέως (σε 10 εως 30 λεπτά) και δοσο-εξαρτώμενα (EC50 στην τάξη των nM) τα επίπεδα των Κατεχολαμινών (Νορεπινεφρίνης και Ντοπαμίνης). Η τάχιστη δράση των στεροειδών στην έκλυση των Κατεχολαμινών επιτυγχάνεται μέσω του αποπολυμερισμού του υπομεμβρανικού δικτύου ακτίνης, ένα κυτταρικό σύστημα γρήγορης απόκρισης στην εξωκύττωση των εκκριτικών κοκκίων των Κατεχολαμινών. Η παρουσία ενός σταθεροποιητή του δικτύου ακτίνης, της Φαλασιδίνης, ανέστειλλε πλήρως την επαγώμενη από τα στεροειδή έκλυση των Κατεχολαμινών.Οι DHEAS και Αllo, κι όχι η DHEA, επίσης διέγειραν την σύνθεση των Κατεχολαμινών, αυξάνοντας τα επίπεδα των τελευταίων σε 24 ώρες, μια δράση που αναστέλλεται πλήρως παρουσία των αναστολέων της Υδροξυλάσης της Τυροσίνης, AMPT και Δεκαρβοξυλάσης των L-αρωματικών αμινοξέων, NSD1015. Οι DHEAS και Αllo επίσης αύξησαν τα επίπεδα mRNA και πρωτεϊνης της Υδροξυλάσης της Τυροσίνης, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση ρύθμισης εκ των στεροειδών αυτών της σύνθεσης των Κατεχολαμινών. Η ακριβής φύση του υποδοχέα που διαμεσολαβεί τις ταχείες δράσεις των DHEA και DHEAS στα κύτταρα PC12 δεν έχει αποσαφηνιστεί. Οι αντι-αποπτωτικές δράσεις φαίνεται να είναι ανεξάρτητες των NMDA και GABA υποδοχέων, αφού τα κύτταρα PC12 δεν εκφράζουν λειτουργικές μορφές των υποδοχέων αυτών και δεν αποκρίνονται στους αγωνιστές τους. Η ταχεία κινητοποίηση των αντι-αποπτωτικών μηχανισμών της DHEA στα κύτταρα PC12 υποστηρίζει την υπόθεση πως το νευροστεροειδές αυτό ίσως χρησιμοποιεί ειδικές μεμβρανικές θέσεις. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η μη διαπερατή από την κυτταρική μεμβράνη DHEA-BSA διατηρεί την αντι-αποπτωτική δράση της ελεύθερης DHEA. Επιπλέον, πειράματα συνδέσης κορεσμού της [3Η]DHEA σε απομονωθείσες μεμβράνες κυττάρων PC12 αλλά και κυττάρων ιπποκάμπου επίμυος ή χρωμιόφιλων κυττάρων ανθρώπου έδειξαν την παρουσία ειδικών μεμβρανικών θέσεων πρόσδεσης της DHEA (KD της τάξης των nM). Οι μεμβρανικές αυτές θέσεις πρόσδεσης της DHEA είναι λειτουργικώς συζευγμένες με G-πρωτεϊνες, αφού η παρουσία της τοξίνης ΡΤΧ ανέστειλλε πλήρως την αντι-αποπτωτική δράση της DHEA-BSA. Σε αντίθεση με την μη πρόσδεση των Οιστρογόνων και της Προγεστερόνης, η Τεστοστερόνη και η Κορτικοστερόνη εκτόπισαν την προσδεδεμένη DHEA, δρώντας ως ανταγωνιστές αφού ανέστειλλαν την αντι-αποπτωτική δράση της DHEA, καθώς και την διεγερτική δράση της στην έκφραση των προ-επιβιωτικών πρωτεϊνών Βcl-2/Bcl-xL και της κινάσης Src. Tα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι η DHEA πιθανόν ασκεί την νευροπροστατευτική της δράση μέσω ειδικών μεμβρανικών θέσεων, διαφορετικών των υποδοχέων NMDA, GABAΑ και Σίγμα- 1. Προς διερεύνηση των σχέσεων δομής-αντιαποπτωτικής δράσης της DHEA και της Allo, ελέγχθηκε η αντι-αποπτωτική τους δράση σε σύγκριση με μια σειρά δομικά συγγενών αναλόγων τους. Οι προ-επιβιωτικές δράσεις τους φαίνεται ότι απαιτούν συγκεκριμένες δομές, με την διαμόρφωση 3β-ΟΗ για τα ανδροστένια και την διαμόρφωση 3α-ΟΗ για τα πρεγνάνια να είναι δραστικές. Πράγματι, τα 3-κέτο, Δ4, ή C7-υδροξυλιωμένα ανάλογα ανδροστενίων και τα 3β παράγωγα πρεγνανίων δεν είχαν αντι-αποπτωτική δράση. Επιπροσθέτως, ένα συνθετικό ανάλογο (ΤC50) που ελέγχθηκε έδειξε ισχυρή αντι-αποπτωτική δράση στα συμπαθητικοαδρενεργικά κύτταρα με EC50 ίση με 0,087nM. Το μόριο TC50 προσδένεται με υψηλή χημική συγγένεια στην μεμβρανική θέση πρόσδεσης της DHEA (με KD της τάξης του pM), ενώ μιμείται και την επαγωγική δράση της DHEA στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας προτείνουν πως τα Νευροστεροειδή όπως η DHEA, πιθανόν δρουν ως αντι-αποπτωτικοί, νευροπροστατευτικοί παράγοντες μέσω ειδικών μεμβρανικών θέσεων πρόσδεσης, και ρυθμίζοντας εν συνεχεία κύριες προ-επιβιωτικές κινάσες, καθώς και την έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Τέλος, τα ευρήματά μας με το συνθετικό ανάλογο της DHEA, ΤC50, δείχνουν πως το στεροειδές αυτό ενδεχομένως να αποτελέσει ένα μόριο-οδηγό για την σύνθεση πρωτότυπων νευροπροστατευτικών χημικών ενώσεων, στερούμενων άλλων ενδοκρινών δράσεων.
|
Διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της νευροπροστατευτικής δράσης των νευροστεροειδών και νευροπεπτιδίων: επίδραση στη έκφραση των αποπτωτικών παραγόντων
