| Περίληψη |
Στα πλαίσια της προσπάθειας του εργαστηρίου μας για τη λειτουργική ανάλυση γονιδίων που χαρτογραφούνται στο χρωμόσωμα 10 του ανθρώπου και σχετίζονται με κλινικούς φαινοτύπους μελετήσαμε το γονίδιο FRA10AC1, που χαρτογραφείται στην εύθραυστη χρωμοσωμική θέση FRA10Α (10q23.3-q24.2). Η FRA10A ανήκει στις σπάνιες ευαίσθητες στο φυλλικό οξύ εύθραυστες θέσεις και συγκεκριμένα είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενη σπάνια εύθραυστη αυτοσωμική θέση. Με βάση πρόσφατα αποτελέσματα της ομάδας μας, διαπιστώθηκε ότι η εκδήλωση της FRA10A σχετίζεται άμεσα με την επέκταση και την υπερμεθυλίωση μιας τρινουκλεοτιδικής επανάληψης CGG στο 5 UTR του γονιδίου FRA10AC1. Η εμφάνιση της FRA10A έχει συσχετιστεί με διανοητική καθυστέρηση. Η παρούσα εργασία συμβάλει στην ανάπτυξη ενός ζωικού μοντέλου της ασθένειας στο ποντίκι, στο οποίο το ένα ή και τα δύο αλληλόμορφα του Fra10Ac1 θα έχουν απενεργοποιηθεί. Αυτό θα επιτρέψει τη λεπτομερέστερη περιγραφή του φαινοτύπου της μερικής ή ολικής απώλειας της έκφρασης του FRA10AC1. Το γονιδίο Fra10Ac1 είναι μοναδιαίο στο γονιδίωμα του ποντικού. Επομένως, η απενεργοποίησή του με ομόλογο ανασυνδυασμό θα συμβάλει σημαντικά στη μελέτη της λειτουργίας του. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης ποντικού στελέχους 129SV για την απομόνωση γενωμικών κλώνων που θα χρησιμοποιηθούν για την απενεργοποίηση του ενδογενούς γονιδίου, ο σχεδιασμός της τελικής κατασκευής-στόχου και των ενδιάμεσων κατασκευών που απαιτούνται για την επίτευξή της καθώς και η δημιουργία αυτών. Για τη διερεύνηση της βιβλιοθήκης χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικοί ραδιοσημασμένοι ανιχνευτές που παρασκευάστηκαν από γενωμικό DNA ή cDNA του Fra10Ac1 του ποντικού. Κάθε πείραμα διερεύνησης πραγματοποιήθηκε σε ~3x105 κλώνους. Συνολικά απομονώθηκαν έξι διαφορετικοί μοναδιαίοι κλώνοι, που εκτείνονται από το εξόνιο 1 μέχρι και το εξόνιο 11 του γονιδίου. Ο έλεγχος της ακεραιότητας των κλώνων και η χαρτογράφησή τους στη γενωμική αλληλουχία έγιναν, είτε τεμαχίζοντάς τους με περιοριστικά ένζυμα που αναγνωρίζουν θέσεις στη γενωμική αλληλουχία, είτε πραγματοποιώντας PCR με εκκινητές που υβριδοποιούνται στην αλληλουχία αυτή. Από τους κλώνους αυτούς επιλέχθηκε αυτός που περιείχε τα πρώτα εξόνια του γονιδίου και βάσει αυτού σχεδιάστηκαν η τελική κατασκευή-στόχος, καθώς και οι ενδιάμεσες κατασκευές. Τελικά δημιουργήθηκαν τέσσερις ενδιάμεσες κατασκευές, οι οποίες ελέγχθηκαν με ενζυμικό τεμαχισμό καθώς και με αλληλούχηση. Η ανάπτυξη μοντέλου ποντικού Fra10Ac1-/- μπορεί να αντισταθμίσει την απουσία ομόζυγων ατόμων με FRA10A στον άνθρωπο. Η λεπτομερής ανάλυση του φαινοτύπου των ζώων Fra10Ac1-/- και Fra10Ac1+/-, τα οποία μιμούνται αντίστοιχα την ολική ή μερική έλλειψη της πρωτεΐνης Fra10Ac1 πρέπει να περιλαμβάνει μελέτες της ιστολογίας του εγκεφάλου και της συμπεριφοράς των ζώων αυτών καθώς και έλεγχο για πιθανές νοητικές δυσλειτουργίες. Έτσι, το μοντέλο αυτό θα συμβάλλει στη συσχέτιση της λειτουργίας του FRA10AC1 με το φαινότυπο της FRA10A.
|
Δημιουργία πλασμιδιακής κατασκευής για τη στοχευμένη απενεργοποίηση του γονιδίου Fra10Ac1 στο ποντίκι
