|
|
| Κωδικός Πόρου |
uch.biology.phd//2004boutla |
| Τίτλος |
Ανάλυση μικρών μορίων RNA που ελέγχουν μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης |
| Άλλος τίτλος |
Analysis of short RNAS that control gene expression post - trascriptionaly |
|
Συγγραφέας
|
Μπούτλα, Αλεξάνδρα
|
|
Σύμβουλος διατριβής
|
Τσαγρή, Ευθυμία
|
| Περίληψη |
Τα μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης τα οποία ελέγχονται από μικρά RNA αποτελούν το βασικό θέμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Τα μικρά RNA έχουν μέγεθος 21-25 νουκλεοτίδια, ενώ αναγνωρίζουν και αλληλεπιδρούν με το στόχο τους μέσω συμπληρωματικότητας των βάσεων. Τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (small interfering RNA, siRNA) είναι τα καταλυτικά μόρια για τα φαινόμενα μετα-μεταγραφικής σίγησης (PTGS/RNAi). Παράγονται μετά από την πέψη δίκλωνων μορίων RNA (double starnd RNA, dsRNA) από πρωτεΐνες τύπου RNaseΙΙΙ, και καθοδηγούν το μηχανισμό αναγνώρισης και αποικοδόμησης των RNA που ρυθμίζουν. Τα μικρά RNA (miRNA) παρεμποδίζουν τη μετάφραση των mRNA που ρυθμίζουν μέσω πρόσδεσης τους στην 3΄ μη μεταφραζόμενη περιοχή. Αρχικά διερευνήσαμε την ικανότητα συνθετικών siRNA να επάγουν PTGS/RNAi σε έμβρυα ?ροσόφιλας, σε σύγκριση με μακριά dsRNA. Τα siRNA αποτελούνται από δύο συμπληρωματικές αλυσίδες, που η κάθε μία φέρει στο 5΄ άκρο μία φωσφορική ομάδα και έχουν δύο 3΄ προεξέχοντα νουκλεοτίδια. Τα συνθετικά siRNA είναι ικανά να επάγουν PTGS/RNAi με τρόπο όμοιο με αυτών των φυσικών. Συνθετικά siRNA που δεν φέρουν τη 5΄ φωσφορική ομάδα ή έχουν τυφλά άκρα εξακολουθούν να είναι λειτουργικά, αν και λιγότερο αποτελεσματικά από ένα τυπικό siRNA. Αλλαγές στην αλληλουχία των siRNA είχε μόνο μικρή επίπτωση στην ικανότητα τους να επάγουν PTGS/RNAi όπως και οι αλλαγές που επηρεάζουν τη δομή των νουκλεοτιδίων του 3΄ άκρου. Η PTGS/RNAi στα φυτά δεν περιορίζεται στα φυσικά όρια ενός κυττάρου αλλά μπορεί να μεταφερθεί διασυστηματικά σε ολόκληρο το φυτό. Η δυνατότητα της διασυστηματικής εξάπλωσης της PTGS/RNAi έχει παρατηρηθεί και στο νηματώδη Caenorhabditis elegans. Προκειμένου να μελετήσουμε το σήμα της διασυστηματικής μεταφοράς απομονώσαμε εκχυλίσματα RNA από φυτά Nicotiana benthamiana τα οποία παρουσίαζαν σίγηση του γονιδίου αναφοράς GFP. Τα εκχυλίσματα ενέθηκαν σε καινοραβδίτη που έφερε το γονίδιο της GFP και ελέγχθηκε η ικανότητα τους να επάγουν PTGS/RNAi. Από αυτή την ανάλυση προέκυψε ότι σίγηση στο καινοραβδίτη μπορούσε να προκαλέσει ένα μόριο RNA μεγέθους ~85 νουκλεοτιδίων. Μελέτες που είχαν γίνει στο εργαστήριο με το ιοειδές PSTVd είχαν αποδείξει την παρουσία ειδικών για το ιοειδές siRNA σε μολυσμένα φυτά τομάτας. Η παρατήρηση u945 αυτή προκαλεί έκπληξη δεδομένου του ότι το ιοειδές πολλαπλασιάζεται στον πυρήνα ενώ όλες οι πρωτεΐνες του μηχανισμού της PTGS/RNAi εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα. Προκειμένου να διευκρινίσουμε που συσσωρεύονται τα siRNA πραγματοποιήσαμε λεπτομερή υποκυτταρική κλασμάτωση φυτικών ιστών μολυσμένων με το ιοειδές. Ανακλύψαμε ότι τα siRNA ανιχνεύονται στο κυτταρόπλασμα χωρίς να μπορούμε να διευκρινίσουμε πλήρως το ρόλο τους σε σχέση με το ιοειδές. Τέλος ασχοληθήκαμε με τα miRNA. Αρχικά θέλαμε δούμε αν είναι δυνατόν να παρέμβουμε στην λειτουργία των miRNA ενύοντας σε έμβρυα ?ροσόφιλα ολιγονουκλεοτίδια DNA με συμπληρωματική αλληλουχία για ορισμένα miRNA. Η εισαγωγή των αντικωδικών ολιγονουκλεοτιδίων προκάλεσε την εμφάνιση αναπτυξιακών φαινοτύπων που σχετίζονταν με την λειτουργία των miR-2/13. Επιπλέον αναπτύξαμε μια πειραματική μεθοδολογία για την ανίχνευση mRNA των οποίων η μετάφραση ελέγχεται από miRNA. Με την εφαρμογή αυτής της μεθόδου χαρακτηρίσαμε ορισμένα mRNA τα οποία ρυθμίζονται από τα miRNA 2/13.
|
| Γλώσσα |
Ελληνικά |
| Θέμα |
Μετά - μεταγραφική σίγηση; RNA, Μικρά; Δροσόφιλα; RNA, Μικρά Παρεμβαλλόμενα; Γονιδιακή ρύθμιση; DNA, Ρυθμιστικά μη κωδικά |
| Ημερομηνία έκδοσης |
2004-12-07 |
| Συλλογή
|
Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές
|
|
|
Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
|
| Εμφανίσεις |
325 |
Ανάλυση μικρών μορίων RNA που ελέγχουν μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης
