| Περίληψη |
Οι μεταλλοπρωτεΐνες αποτελούν περίπου το ένα τρίτο των πρωτεϊνών που
συναντώνται στα βιολογικά συστήματα. Η παρουσία τους είναι καθοριστικής σημασίας
για βασικές λειτουργίες των κυττάρων αφού στην πλειονότητα τους συνιστούν ένζυμα
και μέρος των μηχανισμών ομοιόστασης των μετάλλων. Οι μεταλλοπρωτεωμικές
αναλύσεις αποτελούν ένα εργαλείο για τον δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό των
μεταλλοπρωτεϊνών, ενώ επιτρέπουν και τον ποσοτικό τους προσδιορισμό,
συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση διαφόρων διεργασιών που λαμβάνουν χώρα
στα βιολογικά συστήματα.
Η χρήση των μεθόδων υγρής χρωματογραφίας συζευγμένων με φασματομετρία
μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (HPLC-ICP-MS) εμφανίζει σημαντική
αύξηση τις τελευταίες δεκαετίες, λόγω της πληθώρας πλεονεκτημάτων που
διαθέτουν. Ειδικότερα, η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού και η
χρωματογραφία χημικής συγγένειας, καθιστούν δυνατό τον διαχωρισμό των
μεταλλοπρωτεϊνών σε ήπιες συνθήκες επιτρέποντας τη διατήρηση της δομής των
πρωτεϊνών και αποτρέποντας τις απώλειες των περιεχόμενων μετάλλων. Παράλληλα,
το ICP-MS επιτρέπει την ανίχνευση των μετάλλων, στα πολύπλοκα βιολογικά
δείγματα, με υψηλή ευαισθησία προσφέροντας και τη δυνατότητα πολυστοιχειακής
ανάλυσης.
Στην παρούσα εργασία αναπτύσσεται μέθοδος χρωματογραφίας μοριακού
αποκλεισμού (HiTrap Desalting HP) και χημικής συγγένειας (HiTrap Blue-HP)
συζευγμένη με φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS)
για την ανάλυση μεταλλοπρωτεϊνών που περιέχουν Mg, Ca, Se, Fe, Co, Ni ή και Ζn
σε δείγματα ορού ανθρώπινου αίματος. Σε αυτές τις αναλύσεις, η χρήση του universal
cell ως κυψελίδα συγκρούσεων με ροή αέριου Ηe 2 ml/min πλεονεκτεί έναντι της
χρήσης της ως κυψελίδα αντίδρασης με ροή αέριου Ο2 1,5 ml/min. Από την ανάλυση
δειγμάτων ορού αίματος διαφορετικών αθλητών, για την πλειονότητα των στοιχείων,
προκύπτουν δύο διαφορετικά χρωματογραφικά προφίλ. Σε δείγματα που ελήφθησαν
για τον ίδιο αθλητή πριν και μετά την άσκηση παρατηρούνται κυρίως μεταβολές στη
συγκέντρωση των μετάλλων στα διάφορα κλάσματα, υποδεικνύοντας την επίδραση
της άσκησης στις μορφές και τις συγκεντρώσεις των μετάλλων στον ορό αίματος.
Παράλληλα, πραγματοποιείται προσπάθεια αντιστοίχισης των κλασμάτων, που
προκύπτουν για κάθε μέταλλο, με τις μεταλλοπρωτεΐνες που περιέχονται στον ορό
αίματος σύμφωνα με τη βιβλιογραφία.
Επιπλέον, στην παρούσα εργασία αναπτύσσεται μέθοδος χρωματογραφίας
μοριακού αποκλεισμού συζευγμένη με φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου
πλάσματος (SEC-ICP-MS) για την ταχεία ανάλυση σεληνοπρωτεϊνών στα κύτταρα
Chlamydomonas reinhardtii. Η μέθοδος αξιοποιείται για την μελέτη των μορφών του
σεληνίου στα κύτταρα που αναπτύχθηκαν παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων
SeO4-. Τα χρωματογραφήματα των δειγμάτων λύσης των κυττάρων υποδεικνύουν την
πρόσληψη ποσότητας Se από τα κύτταρα. Μέρος της ποσότητας αυτής εντάσσεται σε
μακρομόρια (>5 kDa) έως ότου οι συγκεντρώσεις του Se(VI) στην καλλιέργεια
υπερβούν τα 100 μΜ. Η υπόλοιπη ποσότητα Se υφίστανται σε ανόργανη ή και
οργανική μορφή χαμηλού μοριακού βάρους (<5 kDa). Συγκρίνοντας την ολική
συγκέντρωση του Se όπως προέκυψε από τη μέθοδο SEC-ICP-MS και τη συμβατική
μέθοδο ανάλυσης (Conventional ICP-MS), προκύπτει ικανοποιητική ανάκτηση του Se
(>96% )
|
Ανάπτυξη νέων αναλυτικών τεχνικών υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος για την μεταλλοπρωτεωμική ανάλυση περιβαλλοντικών και βιολογικών δειγμάτων
