| Περίληψη |
Στην παρούσα εργασία έγινε μελέτη του συμπλόκου που σχηματίζουν οι πρωτεΐνες HrcQa & HrcQb. Οι δύο πρωτεΐνες, αποτελούν μέρη του βασικού σώματος του τύπου ΙΙΙ εκκριτικού συστήματος, μιας πολυπρωτεϊνικής εκκριτικής μηχανής που συναντάται στα παθογόνα βακτήρια, και η οποία είναι αφιερωμένη στην εξ επαφής μεταφορά παθογόνων παραγόντων στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου ξενιστή. Βάσει των έντονων ομοιοτήτων των HrcQa/ HrcQb με τις FliM/FliN του βακτηριακού μαστιγίου, έχει προταθεί ότι οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν μία υπερμοριακή δομή ανάλογη αυτής του κυτταροπλασματικού δακτυλίου (C-ring) του μαστιγίου, ο οποίος τοποθετείται στην απόληξη του βασικού σώματος.
Σε προηγούμενες δουλειές είχε δειχθεί ότι οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν, αλλά δεν είχε καταστεί δυνατή η απομόνωση διαλυτού συμπλόκου. Από πειράματα υποκυτταρικού εντοπισμού που είχαν πραγματοποιηθεί στο παρελθόν αλλά και από βιουπολογιστικές μελέτες, διαπιστώθηκε ότι το πρόβλημα της διαλυτότητας οφείλεται σε υδρόφοβες περιοχές της HrcQa και συγκεκριμένα στην αμινοτελική της περιοχή. Για την επίτευξη της απομόνωσης διαλυτού συμπλόκου, σχεδιάστηκε μία μορφή του συμπλόκου από την οποία αποκλείστηκαν τα 80 πρώτα αμινοτελικά κατάλοιπα της HrcQa. Η γονιδιακή κατασκευή περιελάμβανε την υπολειμματική αυτή μορφή της HrcQa (HrcQa-Nter) καθώς και την πλήρους μήκους HrcQb η οποία έφερε ακροφύσιο 6 ιστιδινών στο καρβοξυτελικό της άκρο.
Το αποτέλεσμα ήταν η απομόνωση διαλυτού συμπλόκου. Το σύμπλοκο απομονώθηκε με χρωματογραφία Ni-NTA, για το οποίο μόνο η HrcQb-His είχε συγγένεια. Ο συνκαθαρισμός των δύο πρωτεϊνών ήταν αποτέλεσμα του σχηματισμού συμπλόκου. Η στοιχειομετρία του συμπλόκου προβλέπεται ~ 1:3-1:4 (HrcQa:HrcQb) βάσει της στοιχειομετρίας που έχει παρατηρηθεί στο ομόλογο σύμπλοκο FliM:FliN από το βακτηριακό μαστίγιο. Δεδομένου ότι iii
οι δύο πρωτεΐνες εκφράζονται ισόποσα, η περίσσεια της HrcQa-Nter ανακτάται σε ένα πρώιμο βήμα έκλουσης από τη στήλη Ni-NTA.
Η μορφή αυτή του συμπλόκου παρουσίασε πρόβλημα πρωτεόλυσης μετά το πέρας μερικών ημερών από την απομόνωσή του. Η πρωτεόλυση συνέβη στην πρωτεΐνη HrcQa-Nter, με ειδικό τρόπο, ώστε να προκύπτει μια ελλειμματική μορφή της ~14 kDa. Η ελλειμματική αυτή μορφή της HrcQa όχι μόνο είναι ιδιαίτερα σταθερή αλλά διατηρεί την ικανότητα για αλληλεπίδραση με τη HrcQb προς σχηματισμό συμπλόκου. Η ταυτοποίηση της περιοχής αυτής πραγματοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας η οποία υπέδειξε την περιοχή των αμινοξέων 129-238 στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης, επιβεβαιώνοντας προηγούμενα αποτελέσματα τα οποία ανέφεραν την καρβοξυτελική περιοχή της HrcQa ως αναγκαία και επαρκή για την αλληλεπίδραση με τη HrcQb. Βελτιστοποίηση του προτοκόλου απομόνωσης συνέβαλε ώστε το πρόβλημα σχεδόν να εξαλειφθεί.
Το σύμπλοκο σχηματίζει μεγαλομοριακές δομές, των οποίων τα ακριβή μοριακά βάρη δεν κατέστη δυνατόν να προσδιοριστούν.
Για τη HrcQa-Nter προσδιορίστηκε το μοριακό βάρος και η υδροδυναμική ακτίνα δύο πληθυσμών που διαχωρίζονται κατά τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης και οι οποίοι αντιστοιχούν (βάσει θεωρητικών υπολογισμών) σε 10μερές και 5μερές με μεγαλύτερη αφθονία να παρουσιάζει ο πληθυσμός που αντιστοιχεί σε 10μερές.
Επιχειρήθηκαν προκαταρκτικές δομικές μελέτες για το σύμπλοκο με τη μέθοδο της σκέδασης ακτίνων Χ από διάλυμα σε μικρές γωνίες. Οι μετρήσεις δεν ήταν επαρκείς, ωστόσο απέδωσαν τρισδιάστατα μοντέλα για το σχήμα των μεγαλομοριακών δομών που σχηματίζει το σύμπλοκο των δύο πρωτεϊνών.
Τέλος, στα πλαίσια της εργασίας σχεδιάστηκαν γονιδιακές κατασκευές οι οποίες αποσκοπούσαν σε σταθερότερα προϊόντα. Τα προϊόντα που αποδίδουν βρίσκονται ακόμη υπό μελέτη.
|
Μελέτη του συμπλόκου HrcQa-HrcQb από το τυπού ΙΙΙ εκκριτικό σύστημα του φυτοπαθογονού P. syringae pv phaseolicola
