| Περίληψη |
Η αθηρωσκλήρυνση είναι κύρια μια φλεγμονώδης νόσος και όχι απλά το αποτέλεσμα της συσσώρευσης και εναπόθεσης λιπιδίων. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μονοκύτταρα/μακροφάγα και τα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξικού στρες αλλά και υπό την επίδραση διαφόρων κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων, όπως ο transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), η αγγειοτασίνη ΙΙ (angiotensin II), ο basic fibroblast growth factor (bFGF) και η ιντερλευκίνη-1 (interleukin- 1), παράγουν τον vascular endothelial growth factor (VEGF), έναν ισχυρό προ- φλεγμονώδη, αγγειογενετικό και μιτωγόνο παράγοντα. Σε διάφορες μελέτες που έγιναν στο παρελθόν αυτός ο παράγοντας βρέθηκε σε υψηλές συγκεντρώσεις στον ορό ασθενών με στεφανιαία νόσο και σε αθηρωματικές βλάβες στεφανιαίων και περιφερικών αγγείων. Σκοπός της μελέτης είναι η διαλεύκανση του ρόλου των αγγειογενετικών παραγόντων στην εξέλιξη της στεφανιαίας νόσου με απώτερο στόχο την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών της αθηρωγένεσης. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε η έκφραση των VEGF-A, TGF-β1 και bFGF από τα μονοκύτταρα/μακροφάγα και τα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος, ασθενών με στεφανιαία νόσο αλλά και η έκφραση τους από τα μακροφάγα/αφρώδη κύτταρα, αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινων στεφανιαίων αγγείων με αθηρωμάτωση. Επίσης εξετάσθηκε η επίδραση της Fluvastatin και της γλυκόζης στην έκφραση αυτών των παραγόντων στα περιφερικά μονοκύτταρα φυσιολογικών δοτών. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση δύο νέων αυξητικών και αγγειογενετικών παραγόντων, της Heregulin (HRG1-β1), και του CYR61, σε αθηρωματικές βλάβες προς διερεύνηση της συσχέτισης τους με την νόσο. Ελέγχθηκε επίσης η επαγωγική δράση της HRG1-β1 στα επίπεδα έκφρασης του mRNA του CYR61 στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, μονοπύρηνα και λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα 53 δοτών, λίγο πριν υποβληθούν σε στεφανιογραφικό έλεγχο. Οι δέκα επτά από τους δότες ήταν φυσιολογικοί ενώ για τους υπόλοιπους 36 διαγνώστηκε στεφανιαία νόσος ενός, δύο ή τριών αγγείων. Με βάση τα κλινικοπαθολογικά τους ευρήματα χωρίστηκαν σε τρεις βασικές ομάδες: α) φυσιολογικοί δότες, β) ασθενείς με στεφανιαία νόσο και σταθερή στηθάγχη και γ) ασθενείς με στεφανιαία νόσο και ασταθή στηθάγχη. Τα αντίστοιχα mRNAs από τα μονοπύρηνα και τα λεμφοκύτταρα όλων των δοτών εκχειλίστηκαν, ποσοτικοποιήθηκαν και αναλύθηκαν με την μέθοδο της RT-PCR για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των VEGF-A, TGF-β1 και bFGF. Στην συνέχεια πενήντα ml περιφερικού αίματος ελήφθησαν από δύο υγιείς δότες (23 και 27 ετών αντίστοιχα) και τα μονοκύτταρα/μακροφάγα απομονώθηκαν και επιστρώθηκαν σε πλαστικά δοχεία κυτταροκαλλιέργειας. Πραγματοποιήθηκε, ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών με γλυκόζη και Fluvastatin, εκχύλιση από αυτά του mRNA σε συγκεκριμένες χρονικές περιόδους (30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 24 h και 48 h) και περαιτέρω ανάλυση αυτού με την προαναφερθείσα μέθοδο. Για το δεύτερο σκέλος της μελέτης, 26 νεκροτομικά δείγματα στεφανιαίων αρτηριών, προερχόμενα από 8 διαφορετικούς δότες, εξαιρέθηκαν κατά την ιατροδικαστική αυτοψία, εντός οκταώρου από την ώρα κατάληξης. Όλα τα δείγματα αμέσως χωρίστηκαν σε δύο μέρη. Το ένα εκ των δύο βυθίστηκε σε διάλυμα 10% παραφορμαλδεΰδης για περαιτέρω ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική μελέτη. Το δεύτερο μέρος από όλα τα δείγματα φυλάχτηκε σε καταψύκτη -70οC για RNA ανάλυση με την μέθοδο της RT-PCR,για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των VEGF-A, TGF-β1, bFGF, HRG1-β1 και CYR61. Μετά από ιστοπαθολογική εκτίμηση τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε τέσσερεις διαφορετικές ομάδες: α) φυσιολογικές στεφανιαίες αρτηρίες, β) Fatty Streak βλάβες (FS), γ) ινώδεις αθηρωματικές βλάβες και δ) επιπλεγμένες βλάβες. Για την ανοσοϊστοχημική μελέτη των προαναφερθέντων αυξητικών παραγόντων επιλέχτηκαν και χρησιμοποιήθηκαν τα κατάλληλα αντισώματα. Για την διερεύνηση της επαγωγικής δράσης της HRG1-β1 στον CYR61, πραγματοποιήθηκε κυτταροκαλλιέργεια με την ενδοθηλιακή κυτταρική σειρά EA.hy926. Τα κύτταρα ενεργοποιήθηκαν με HRG1-β1 και εν συνεχεία απομονώθηκε το mRNA σε διαφορετικές χρονικές περιόδους (6h, 12h, 24h και 48h) για την εξέταση της έκφρασης του CYR61. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι υπάρχει σημαντική αύξηση στην έκφραση των επιπέδων του mRNA των παραγόντων VEGF-A και bFGF στα μονοκύτταρα/μακροφάγα των ασθενών με στεφανιαία νόσο, σακχαρώδη διαβήτη και σταθερή στηθάγχη όταν συγκρίθηκαν με αυτά των φυσιολογικών δοτών (P=0,041 και P=0,022 αντίστοιχα) αλλά και με αυτά των ασθενών με στεφανιαία νόσο και ασταθή στηθάγχη (P=0,024 και P=0,005 αντίστοιχα). Ακόμα παρατηρήθηκε μια χρονικά εξαρτώμενη προοδευτική μείωση των επιπέδων έκφρασης αυτών των δύο παραγόντων στα μονοκύτταρα/μακροφάγα που ενεργοποιήθηκαν με Fluvastatin και γλυκόζη. εν παρατηρήθηκε έκφραση για τον TGF- β1. Επίσης σταδιακή αύξηση στα πρωτεϊνικά επίπεδα αλλά και στα επίπεδα έκφρασης του mRNA των VEGF-A, TGF-β1, HRG1-β1 και CYR61 παρατηρήθηκε στα κύτταρα του υπενδοθηλιακού χιτώνα (intima) στους διάφορους τύπους στεφανιαίων αθηρωματικών βλαβών. Τέλος κατά την διάρκεια της ενεργοποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων με HRG1-β1 τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του CYR61 παρουσίασαν αύξηση. Τα ευρήματα της μελέτης αυτής υπέδειξαν την σημαντική συσχέτιση που υπάρχει μεταξύ της στεφανιαίας νόσου και αυτών των φλεγμονωδών παραγόντων τόσο στα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος, όσο και στα μακροφάγα/αφρώδη κύτταρα και λεία μυϊκά κύτταρα των στεφανιαίων αθηρωματικών βλαβών. Επίσης στην μελέτη αυτή παρατηρήθηκε ότι η Fluvastatin (στατίνη ευρείας χρήσεως σε ασθενείς με υπερχοληστεριναιμία) δρα κατασταλτικά μειώνοντας την έκφραση των VEGF-A και bFGF. Επιπροσθέτως, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης αυτών των αγγειογενετικών παραγόντων στους ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη και στεφανιαία νόσο, δεν φαίνεται να επάγονται από την άμεση δράση της υπεργλυκαιμίας στα μονοκύτταρα/μακροφάγα όπως προκύπτει από την in vitro μελέτη. Όλοι αυτοί οι αυξητικοί παράγοντες βοηθούν στην δημιουργία και εξέλιξη της νόσου με την συμβολή τους στην ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων για την παραγωγή άλλων κυτταροκινών και αγγειογενετικών παραγόντων. Επίσης συμβάλουν σημαντικά στην διαδικασία μετανάστευσης των μακροφάγων/μονοκυττάρων από το περιφερικό αίμα στην intima, αλλά και των λείων μυϊκών κυττάρων από τον μέσο χιτώνα (media) προς αυτήν. Τέλος, πιθανότατα ενέχονται στην επέκταση της αθηρωματικής πλάκας με την περαιτέρω παραγωγή και εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (extracellular matrix) από τα ενεργοποιημένα λεία μυϊκά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά δίνουν νέα στοιχεία για τον ρόλο των μονοκυττάρων/μακροφάγων στην στεφανιαία νόσο, καθώς επίσης και νέα στοιχεία για τους εμπλεκόμενους κυτταρικούς και βιοχημικούς μηχανισμούς στην δημιουργία της αθηρωματικής πλάκας στα στεφανιαία αγγεία.
|
Σύγκριση επιπέδων έκφρασης των αυξητικών παραγόντων TGF-β, bFGF, EGF, IGF-I και VEGF, στο αίμα ασθενών με στεφανιαία νόσο και φυσιολογικών ατόμων
