| Περίληψη |
Στα θηλαστικά, η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό μεταβολισμό, συνδέοντας των μεταβολισμό των αμινοξέων με αυτόν των υδατανθράκων. Στον εγκέφαλο των θηλαστικών, όπου η GDH εντοπίζεται κυρίως στα αστροκύτταρα, φαίνεται να συμμετέχει στον μεταβολισμό του γλουταμικού ως διαβιβαστή. Η ανθρώπινη GDH υπάρχει σε δύο ισομορφές, που κωδικοποιούνται από τα γονίδια GLUD1 και GLUD2, αντιστοίχως, και διαφέρουν, στην ώριμη μορφή τους, σε μόνο 15 από τα 505 αμινοξέα τους. Το γονίδιο GLUD1 είναι αυτοσωματικό, περιέχει ιντρόνια και εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου και του εγκεφάλου. Αντιθέτως, το γονίδιο GLUD2 βρίσκεται στο Χ χρωμόσωμα, δεν περιέχει ιντρόνια και εκφράζεται ειδικώς στον εγκέφαλο και τον όρχι. Τα δύο αυτά ισοένζυμα GDH στον άνθρωπο διαφέρουν σημαντικά ως προς τις κινητικές τους ιδιότητες και την αλλοστερική τους ρύθμιση, παρά τις μικρές μόνο διαφορές στην αμινοξική αλληλουχία τους. Συγκεκριμένα, η GLUD1 αναστέλλεται ισχυρά από μικρές συγκεντρώσεις GTP και η αναστολή αυτή εμφανίζει θετική συνεργατικότητα, ενώ η GLUD2 απαιτεί πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις GTP για να ανασταλεί και η αναστολή συτή χαρακτηρίζεται από αρνητική συνεργατικότητα. Επιπλέον, η GLUD2 σε απουσία ADP ή L-λευκίνης είναι σχεδόν ανενεργή, σε αντίθεση με το GLUD1 ισοένζυμο, το οποίο παρουσιάζει μία σημαντική βασική δραστηριότητα σε απουσία ενεργοποιητών. Η προσθήκη ADP ή L- λευκίνης στην αντίδραση ενεργοποιεί σημαντικά το GLUD2 ισοένζυμο, αποκαθιστώντας την δραστηριότητά του σε επίπεδα παρόμοια με αυτά της GLUD1. Οι παραπάνω ιδιότητες επιτρέπουν πιθανότατα στο GLUD2 ισοένζυμο να λειτουργεί στις ιδιαίτερες συνθήκες του νευρικού ιστού, όπως είναι οι καταστάσεις χαμηλού ενεργειακού φορτίου (υψηλή αναλογία ADP:ATP) κατά τη διάρκεια της έντονης γλουταματεργικής διαβίβασης και οι υψηλές συγκεντρώσεις GTP στον εγκέφαλο. Με σκοπό να διερευνήσουμε την δομική βάση των μεγάλων αυτών λειτουργικών διαφορών των δύο ισοενζύμων GDH, πραγματοποιήσαμε ειδική ως προς τη θέση μεταλλαξιογένεση στο GLUD1 ένζυμο σε θέσεις όπου αυτό διαφέρει από το GLUD2 ισοένζυμο, αντικαθιστώντας το κάθε αμινοξύ σε αυτές τις θέσεις με το αντίστοιχό του vi που υπάρχει στην GLUD2. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η αντικατάσταση της Gly456 από Ala έκανε το ένζυμο ανθεκτικό στην αναστολή από GTP και οδήγησε στην απώλεια της θετικής συνεργατικότητας αυτής της αναστολής. Επιπλέον, αντικατάσταση της Arg443 από Ser κατήργησε την βασική δραστηριότητα του μεταλλαγμένου GLUD1 ενζύμου και το έκανε να αποκτά επίπεδα δραστηριότητας συγκρίσιμα με αυτά του αρχικού ενζύμου μόνο μετά από την προσθήκη ADP στην αντίδραση. Μεταλλάξεις σε μία σειρά από θέσεις στις οποίες διαφέρουν τα δύο GDH ισοένζυμα μεταξύ τους (Ser331Thr, Met370Leu, Met415Leu, Arg470His και Asn498Ser) δεν επηρέασαν την αλλοστερική ρύθμιση και τις κινητικές ιδιότητες του GLUD1 ισοενζύμου. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, έγινε εμφανές ότι οι κύριες λειτουργικές διαφορές μεταξύ των δύο GDH ισοενζύμων μπορούν να αποδοθούν σε δύο μόνο αμινοξικές αντικαταστάσεις (Arg443Ser και Gly456Ala). Το χωρίς ιντρόνια GLUD2 γονίδιο έχει δειχθεί ότι δημιουργήθηκε από το GLUD1 γονίδιο με μηχανισμό ρετρομετάθεσης σε κάποιο κοινό πρόγονο του ανθρώπου και των πιθήκων. Στη συνέχεια, ο συνδυασμός τυχαίων μεταλλάξεων και της πίεσης της φυσικής επιλογής προσέδωσε στο GLUD2 γονίδιο τις σημερινές του ιδιότητες. Οι δύο αμινοξικές αντικαταστάσεις Arg443Ser και Gly456Ala είναι, σύμφωνα με τις μελέτες μας, οι κύριες εξελικτικές αλλαγές που οδήγησαν στην προσαρμογή της GLUD2 GDH στις ιδιαίτερες μεταβολικές ανάγκες του νευρικού ιστού, συνεισφέροντας πιθανότατα στην σημαντική λειτουργική διαφοροποίηση του ανθρώπινου εγκεφάλου από αυτόν των άλλων θηλαστικών.
|
Μελέτη των δομικών και λειτουργικών διαφορών μεταξύ των δύο ανθρώπινων ισοενζύμων γλουταμικής αφυδρογόνασης
