| Περίληψη |
Το περιβαλλοντικό DNA (eDNA), δηλαδή γενετικό υλικό που έχει αποκτηθεί απευθείας από
κάποιο περιβάλλον (έδαφος, ίζημα, νερό κ.λπ.) χωρίς κάποια εμφανή σημάδια βιολογικών πηγών από
το οποίο προέρχεται [1],και η τεχνική της μετακωδικοποίησης, μια μέθοδος κωδικοποίησης DNA που
επιτρέπει τη ταυτοποίηση μιγμάτων οργανισμών κάνοντας χρήση καθολικών εκκινητών της
Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR), επιδιώκουν να γυρίσουν σελίδα στο τρόπο με τον οποίο η
βιοποικιλότητα γίνεται αντιληπτή και παρακολουθείται. Ο συνδυασμός τους θεωρείται πως είναι μια
γρήγορη μέθοδος αξιολόγησης της βιοποικιλότητας. Επιπλέον, η μετακωδικοποίηση του
περιβαλλοντικού DNA είναι μια ολιστική προσέγγιση που, μόλις τυποποιηθεί, επιτρέπει μεγαλύτερη
ικανότητα ανίχνευσης και σε χαμηλότερο κόστος σε σύγκριση με τις συμβατικές μεθόδους εκτίμησης
της βιοποικιλότητας.
Παρόλο που η μετακωδικοποίηση κερδίζει έδαφος ως μια γρήγορη μη επεμβατική τεχνική
εκτίμησης της βιοποικιλότητας, πρέπει να αντιμετωπιστούν πολλά θέματα της μεθόδου. Η μη ύπαρξη
ενός τυποποιημένου πρωτοκόλλου για αυτό το είδος ανάλυσης, η μεροληψία συγγένειας του εκκινητή
λόγω της χρήσης των γενικών εκκινητών και της διαφορετικής σχετικής πυκνότητας κάθε ακολουθίας
στο δείγμα, καθώς και η δυσκολία προσδιορισμού των αφθονιών των ειδών, αποτελούν εμπόδια
ζωτικής σημασίας για τις μελέτες βιοποικιλότητας.
Το κύριο μέλημα της παρούσας διατριβής, είναι η αντιμετώπιση ορισμένων από αυτά τα
μειονεκτήματα σχετικά με την μετακωδικοποίηση του περιβαλλοντικού DNA, αφενός σχεδιάζοντας
εκκινητές παρεμπόδισης για την αντιμετώπιση του "προβλήματος των εκκινητών" (ως τέτοιο, ορίζονται
οι μεροληψίες που οφείλονται στη χρήση γενικών εκκινητών) στην περίπτωση των Μυκήτων, αφετέρου
φτιάχνοντας μια τυποποιημένη γραμμή εργασίας για την ανάλυσή του.
Λόγω μεροληψιών που συμβαίνουν κατά την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, ακολουθίες
χαμηλής αφθονίας στα δείγματα σε σύγκριση με άλλες Ταξινομικές Λειτουργικές Μονάδες (OTUs), δεν
ενισχύονται αποτελεσματικά. Οι Μύκητες συνήθως επικρατούν στα περιβαλλοντικά δείγματα και,
συνεπώς, είναι υπεύθυνοι για ένα σημαντικό και ανεπιθύμητο θόρυβο στο προϊόν της Αλυσιδωτής
Αντίδρασης Πολυμεράσης. Προκειμένου να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, δηλαδή για να αποφευχθεί
η ενίσχυση των Μυκήτων κατά την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, εκκινητές παρεμπόδισης για
τα δύο γονίδια δείκτες (16S rRNA και COI) σχεδιάστηκαν in silico. Οι προβλεπόμενοι εκκινητές
παρεμπόδισης αξιολογήθηκαν, επίσης in silico; στην περίπτωση γονιδίου δείκτη 16S τα αποτελέσματα
ήταν πολλά υποσχόμενα μιας και το ζεύγος των εκκινητών παρεμπόδισης που προέκυψε, δεν εμπόδισε
την ενίσχυση των Bακτηρίων. Στην περίπτωση του γονιδίου δείκτη COI, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι
υπάρχει ένα μικρό ποσοστό ευκαρυωτικών αλληλουχιών που αποκλείονται, μαζί με την επιθυμητή
απόφραξη των μυκητιακών ακολουθιών. Ωστόσο, τα σχεδιασμένα ζεύγη εκκινητών παρεμπόδισης για
αμφότερα τα γονίδια δείκτες, φαίνεται πως έχουν τη δυνατότητα να ενεργούν ως τέτοιοι και πλέον θα
πρέπει να δοκιμαστούν περαιτέρω στο εργαστήριο.
Επιπλέον, καμία τυποποιημένη ροή εργασίας για την ανάλυση των εκατομμυρίων αλληλουχιών
που προκύπτουν ως προϊόν της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης ανά πείραμα, έχει αναπτυχθεί.
Πληθώρα εργαλείων βιοπληροφορικής παρέχονται για κάθε βήμα της ανάλυσης αυτής, ωστόσο δεν
υπάρχει μια συγκεκριμένη συλλογή εργαλείων που να έχει αξιολογηθεί a priori και να έχει δοκιμαστεί
επαρκώς, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως το "χρυσό πρότυπο" για κάθε ανάλυση
μετακωδικοποίησης.
Για το σκοπό αυτό, ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να οικοδομηθεί μια πλήρης και
αποτελεσματική ροή εργασίας (με τον τίτλο "P.E.M.A.") για αμφότερα τα γονίδια δείκτες 16S και COI.
Μια γλώσσα προγραμματισμού ειδική για τη σχεδίαση ροών εργασίας που σχετίζονται με την
επεξεργασία δεδομένων, που ονομάζεται Big Data Script (BDS), χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό του
P.E.M.A., του οποίου τα αρχεία εισόδου είναι ακατέργαστα αρχεία ανάγνωσης αλληλουχιών (.fastq
αρχεία). Διαφορετικοί αλγόριθμοι ομαδοποίησης (Μοριακών) Λειτουργικών Ταξινομικών Μονάδων
((M) OTU) καθώς και διαφορετικές μέθοδοι απόδοσης ταξινομίας σε αυτές, παρέχονται στον χρήστη,
ανάλογα με το επιλεγμένο γονίδιο δείκτη και τις ιδιαιτερότητες του συνόλου των δεδομένων του
πειράματός. Το P.E.M.A. αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο σύνολα δεδομένων από δημοσιευμένες
μελέτες και τα παραγόμενα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με εκείνα των μελετών. Προτείνεται ότι το
P.E.M.A. μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ακριβή ανάλυση μελετών μετακωδικοποίησης
περιβαλλοντικού DNA και συνεπώς μπορεί να ενισχύσει την εφαρμογή της βιοποικιλότητας επόμενης
γενιάς σε μελέτες αξιολόγησης.
|
eDNA metabarcoding for biodiversity assessment: algorithm design and bioinformatics analysis pipeline implementation
