| Περίληψη |
Τα miRNA είναι μικρά ρυθμιστικά RNA μόρια που προσδένονται σε μερικώς συμπληρωματικές αλληλουχίες του 3΄UTR των mRNA και παρεμποδίζουν την μετάφρασή τους. Κάθε miRNA στοχεύει ένα μεγάλο αριθμό μεταγράφων ασκώντας με αυτόν τον τρόπο πλειοτροπικό έλεγχο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Σήμερα η εύρεση και η περεταίρω πειραματική απόδειξη των miRNA:mRNA αλληλεπιδράσεων συγκεντρώνει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Πρόσφατες εργασίες εμπλέκουν βασικούς παράγοντες της βιογένεσης των miRNA στη ρύθμιση της διαίρεσης και την διατήρηση της ταυτότητας των αρχέγονων γαμετικών κυττάρων στην Drosophila melanogaster.
Στην παρούσα εργασία αρχικά παρουσιάζεται η in-vivo πειραματική απόδειξη της αρνητικής μετα-μεταγραφικής ρύθμισης που επιβάλλει το miR-13 στο γονίδιο CG10222 μέσω του 3΄UTR του, στην Drosophila. Για τον σκοπό αυτό παρήχθησαν και αναλύθηκαν διαγονιδιακές σειρές «αισθητήρες» στις οποίες το γονίδιο ανταποκριτής EGFP συνδέθηκε με το αγρίου τύπου CG10222-3΄UTR ή με κατάλληλα τροποποιημένες παραλλαγές του. Η έκφραση της EGFP σε προνύμφες τρίτου σταδίου παρέμεινε χαμηλή παρουσία του αγρίου τύπου CG10222-3΄UTR, ενώ αντίθετα ανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα όταν το σημείο πρόσδεσης για το miR-13 είχε αλλοιωθεί. Αντίστοιχα, η παραγωγή κλώνων κυττάρων όπου απουσίαζαν τα miRNA συντέλεσε στην άνοδο των επιπέδων έκφρασης του αισθητήρα. Επιπροσθέτως παρατηρήθηκε ότι η μετα-μεταγραφική αρνητική ρύθμιση που επέβαλε το miR-13 στο CG10222 υπερίσχυε του ρυθμού μεταγραφής από τον ενδογενή υποκινητή. Παράλληλα με τα παραπάνω, μελετήθηκε το φαινόμενο της αυθόρμητης σίγησης των διαγονιδίων ως παραπροϊόν του γενετικού μετασχηματισμού της Drosophila.
Με οδηγό την απόκριση της χίμαιρας EGFP/CG10222-3΄UTR απέναντι στο miR-13 οι σειρές αισθητήρες αποτέλεσαν ένα βασικό εργαλείο για τη μελέτη του προτύπου ενεργότητας των miRNA στην αρσενική γαμετική σειρά. Η ανάλυση της έκφρασης της EGFP σε όρχεις από προνύμφες τρίτου σταδίου και ενήλικα άτομα αποκάλυψε υψηλή miR-13 ενεργότητα στα πρώιμα προ-μειωτικά γαμετικά κύτταρα. Κατά την ωρίμανση των σπερματοκυττάρων, πριν την είσοδό τους στην μείωση, η ενεργότητα του miR-13 σταδιακά αναιρέθηκε. Το ίδιο πρότυπο ενεργότητας καταγράφηκε κατά την ανάλυση σειρών αισθητήρων και για άλλα miRNA προτείνοντας την γενίκευση των παρατηρήσεων για όλα συνολικά τα γαμετικά εκφραζόμενα miRNA.
Η ανίχνευση του προτύπου έκφρασης ενός miRNA από την υποοικογένεια miR-2/miR-13 έδειξε ότι παράγονταν και σε ωριμότερους πληθυσμούς προ-μειωτικών σπερματοκυττάρων όπου δεν ήταν πλέον ενεργό. Βάση αυτής της παρατήρησης δημιουργήθηκαν ενδείξεις για την ύπαρξη ενός ενεργού μηχανισμού αναχαίτισης της δράσης των miRNA κατά την περίοδο ωρίμανσης των σπερματοκυττάρων. Η miRNA-ελεγχόμενη σίγηση του ανταποκριτή έγινε καθολική όταν οι σειρές αισθητήρες συνδυάστηκαν γενετικά με τα μεταλλάγματα των spermatocyte arrest, sa και off-schedule, ofs. Αντίθετα το πρότυπο σίγησης δεν αλλοιώθηκε στα μεταλλάγματα των always early και boule, τα οποία φυσιολογικά δραστηριοποιούνται στον ίδιο κυτταρικό πληθυσμό. Η συσχέτιση των ευρημάτων της παρούσας εργασίας οδηγεί σε ένα μοντέλο κατά το οποίο τα miRNA εκφράζονται και δρουν στα πρώιμα γαμετικά κύτταρα της αρσενικής σειράς. Κατά την πρόοδο της σπερματογένεσης, στο στάδιο των ωριμαζόντων σπερματοκυττάρων, τα γονίδια sa και ofs ακυρώνουν την δράση των miRNA μέχρι που τα miRNA παύουν να παράγονται.
|
Χαρακτηρισμός προτύπων δράσης μικρών RNA στην αρσενική γαμετική σειρά της Drosophila melanogaster
