| Περίληψη |
Το ινοσάρκωμα ορίζεται ως κακοήθης όγκος των μαλακών μορίων , αποτελούμενος
από ινοβλάστες. Είναι ασυνήθης όγκος καθώς αριθμεί λιγότερο του 1% στους ενήλικες και
του 7% όλων των παιδιατρικών κακοηθειών. Δεν υπάρχουν ανοσολογικοί δείκτες για αυτόν
τον τύπο κυττάρων, με αποτέλεσμα η διάγνωση του ινοσαρκώματος με ανοσοϊστοχημικές
μεθόδους να γίνεται εξ αποκλεισμού από τους άλλους τύπους σαρκωμάτων.
Οι πρωτεογλυκάνες είναι θειομένες πρωτεΐνες αποτελούμενες από έναν πρωτεινικό
κορμό συνδεδεμένο με γλυκοζαμινογλυκάνες. Συμμετέχουν στη ρύθμιση σημαντικών
κυτταρικών γεγονότων όπως, κυτταρική προσκόλληση, διήθηση, διαφοροποίηση και
πολλαπλασιασμό. Συμμετέχουν επίσης στην οργάνωση του εξωκυττάριου χώρου μέσω των
αλληλεπιδράσεων τους με σημαντικά μακρομόρια όπως, το κολλαγόνο, τις λιποπρωτεϊνες
και τους αυξητικούς παράγοντες. Λίγα είναι γνωστά για τις PGs και GAGs στους όγκους των
μαλακών μορίων. Όγκοι του στρώματος και όγκοι ινώδους ιστού περιέχουν PGs και GAGs
σε υψηλότερα επίπεδα από ότι ο περιβάλλον ιστός. Η ανάπτυξη του καρκίνου ως εξέλιξη με
πολλά βήματα χρειάζεται μεταξύ των άλλων και επιπλέον μελέτες για των χαρακτηρισμό της
ανάμειξης των διαφόρων πρωτεογλυκανών σε κάθε βήμα των νεοπλασιών. Καθορισμός του
ρόλου της κάθε πρωτεογλυκάνης και ξεχωριστά των εκκρινόμενων ή/και των συνδεδεμένων
με την κυτταρική μεμβράνη πρωτεογλυκανών στους παθολογικούς μηχανισμούς. Η
πληρέστερη ανάλυση της δομής των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων πρέπει επίσης να
συσχετίζεται με την παθολογική ανατομική. Πιστεύεται, ότι η γνώση της δομής και του
ρόλου ειδικών πρωτεογλυκανών θα προσφέρει μηχανισμούς δράσης που θα βοηθήσουν την
θεραπεία του καρκίνου.
Για την μελέτη της έκφρασης των πρωτεογλυκάνων σε κύτταρα ινοσαρκώματος
χρησιμοποιήσαμε ως βιολογικά μοντέλα δυο κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος από
άνθρωπο την HT1080 και την B6FS. Τα κύτταρα ΗΤ1080 χαρακτηρίζονται ως επιθηλιακά,
ενώ τα B6FS κύτταρα ως ινοβλαστοειδή, καθώς επίσης και φυσιολογικούς ινοβλάστες (DLF)
απο πνεύμονα ανθρώπου. Ξεκινήσαμε με τον χαρακτηρισμό των πρωτεογλυκανών και των
υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων που εκφράζει η κάθε μια από τις κυτταρικές σειρές.
Στη συνέχεια, μελετήσαμε την επίδραση των αυξητικών παραγόντων, και συγκεκριμένα των
PDGF-BB, FGF, και TGF, στα επίπεδα των έκφρασης των πρωτεογλυκανών.
Η περιοχή γύρω από το κύτταρο αποτελείται κυρίως από τη πρωτεογλυκάνη
βερσικάνη και το υαλουρονικό οξύ που σχηματίζουν ένα σύμπλοκο. Σε πολλούς
νεοπλαστικούς ιστούς η αλλαγή της έκφρασης της βερσικάνης και του υαλουρονικού οξέους
σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου. Στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη η
αυξημένη έκφραση βερσικάνης στα στρωματικά κύτταρα και σε αυτά γύρω από τον όγκο
χρησιμοποιείται σαν καρκινικός δείκτης. Συμπληρωματικά, αυξημένη έκφραση του
υαλουρονικού οξέος σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου , του
πνεύμονα και του μαστού. Στόχοι της μελέτης ήταν 1) ο χαρακτηρισμός των επιπέδων
έκφρασης της βερσικάνης και του υαλουρονικού οξέος στα κύτταρα ινοσαρκώματοςκαι 2) η
επίδραση των PDGF-BB, FGF, και TGF αυξητικών παραγόντων στη βιοσύνθεση των
παραπανω. Οι κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι HT1080
και B6FS. Επίσης,ινοβλάστες από τον πνεύμονα ανθρώπου (DLF) χρησιμοποιήθηκαν ώστε
να συγκριθούν με τα καρκινικά κύτταρα.
Η κύρια ισομορφή βερσικάνης που εκφράζουν τα DLF και τα B6FS είναι η
βερσικάνη 0 (V0) και η βερσικάνη 1(V1). Χορήγηση TGFΒ2 στα B6FS κύτταρα έδειξε μια
στατιστικά συμαντική αύξηση στα επίπεδα των mRNA μεταγράφων των ισομορφών V0 και
V1, όπως αναλύθηκε με τη μέθοδο real time PCR. Τα ΗΤ1080 κύτταρα εκφράζουν χαμηλά
επίπεδα της V1, η έκφραση της οποίας δεν επηρεάστηκε από κανέναν από τους τρείς
αυξητικούς παράγοντες. Ανιχνεύσιμη ποσότητα πρωτείνης βερσικάνης βρέθηκε μόνο στους
φυσιολογικούς ινοβλάστες με τη μέθοδο western blotting. Επίσης, χορήγηση TGFΒ2 στους
φυσιολογικούς ινοβλάστες είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της βερσικάνης στα DLF
κύτταρα. Μέτρηση του ολικού υαλουρονικού οξέος, με τη μέθοδο ELISA, έδειξε τον
διπλασιασμό και την εννιά φορές αύξηση του υαλουρονικού οξέος στους φυσιολογικούς
ινοβλάστες συγκρίνοντάς την με τα B6FS και ΗΤ1080 κύτταρα ινοσαρκώματος, αντίστοιχα.
Στα ΗΤ1080 η βιοσύνθεση του υαλουρονικού οξέος αυξήθηκε με την χορήγηση bFGF , ενώ
στα B6FS βιοσύνθεση του υαλουρονικού οξέος αυξήθηκε με την χορήγηση των TGFΒ2 και
PDGF-BB. Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση σε επίπεδο μεταγράφων των HAS 1, 2 και
3 με τη μέθοδο Real Time PCR. Τα HT1080 εκφράζουν και τις τρεις ισομορφές των HAS.
Ο bFGF δείχνει να επηρεάζει τα επίπεδα των HAS αλλάζοντας την ισοροπία μεταξύ τους.
Τα Β6FS κύτταρα εκφράζουν μόνο την HAS 2 ισομορφή, της οποίας τα επίπεδα έκφρασης
αυξάνονται κατα τη χορήγηση των PDGF-BB και TGFB2. Συμπερασματικά, τα
αποτελέσματα μας προτείνουν την ύπαρξη ενός αυτοκρινούς βιολογικού μονοπατιού στα
κύτταρα ινοσαρκώματος το οποίο μπορεί να ρυθμίζει, μέσω της έκκρισης των αυξητικών
παραγόντων την αύξηση συγκεκριμένων ισομορφών HAS, την βιοσύνθεση του
υαλουρονικού οξέος, καθώς επίσης την έκκριση και την κατανομή του στην εξωκυττάρια
θεμέλια ουσία. Το μονοπάτι αυτό έχει την ικανότητα να καθορίζει τη σύσταση της
εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, η οποία είναι σημαντική για τον ρυθμό ανάπτυξης των
καρκινικών κυττάρων, την διηθητική τους ικανότητα και την μετανάστευση.
Μια από τις πιο σημαντικές μεμβρανικές πρωτεογλυκάνες για το ινοσάρκωμα και
άλλες μορφές καρκίνου είναι η οικογένεια των συνδεκανών. Οι συνδεκάνες παίζουν
σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στη κυτταρική
διήθηση τόσο στα καρκινικά όσο και στα φυσιολογικά κύτταρα. Η οικογένεια περιλαμβάνει
τέσσερις πρωτεογλυκάνες τις συνδεκάνες-1, -2, -3 και -4. Μελετήσαμε τη δράση της
συνδεκάνης-1 στον πολλαπλασιασμό και στη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων
ινοσαρκώματος. Συγκεκριμένα, τα B6FS κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως το βιολογικό μας
μοντέλο. Τα B6FS εκφράζουν μη ανιχνεύσιμες ποσότητες συνδεκάνης-1 και -3 , ενώ
εκφράζουν χαμηλές ποσότητες συνδεκάνης-2 και υψηλες ποσότητες συνδεκάνης-4, με
ανάλυση FACS. Η συνδεκάνη-1 παίρνει μέρος στην κυτταρική διαίρεση, στη διαφοροποίηση
και στη μετανάστευση των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Επίσης, μελέτες έχουν
δείξει ότι τόσο η κυταροπλασματική όσο και η εξωκυττάρια συνδεκάνης-1 παίζουν
σημαντικό ρόλο στη μετάδοση του σήματος σε βιολογικά μονοπάτια. Υπερέκφραση της
συνδεκάνης-1 και μόνο του κυταροπλασματικού τμήματος της είχε ως αποτέλεσμα τη
μείωση του ρυθμού ανάπτυξης και την μετανάστευσης των κυττάρων B6FS που εκφράζουν
τεχνητά συνδεκάνη-1 (transfected) συγκρινόμενα με τα κυτταρα ελέγχου. Επίσης, η τεχνητή
έκφραση μιας ομάδας πέντε αμινοξέων RMKKK η οποία βρίσκεται στο συντηριμένο
κυτταροπλασματικό κομμάτι της συνδεκάνης-1 είχε ως αποτέλεσμα τη μετακίνηση της
συνδεκάνης-1 στον πυρήνα του κυττάρου. Συμπερασματικά τα διαφορετικά τμήματα της
συνδεκάνης-1 ελέγχουν διαφορετικά τόσο τη κατανομή της συνδεκάνης στο κύτταρο όσο και
τον ρυθμό ανάπτυξής του και τη μεταναστευτική του ικανότητα.
Στη συνέχεια μελετήσαμε τη δράση των πρωτεογλυκανών/ γλυκοζαμινογλυκανών
στη μιτογονική ικανότητα του PDGF-BB. Ο PDGF-BB επάγει την αυτοκρινή ανάπτυξη των
κυττάρων ινοσαρκώματος. Επίσης, είναι γνωστό οτι ο PDGF-BB αλληλεπιδρά με τις
πρωτεογλυκάνες μέσω των γλυκοζαμινογλυκάνων που είναι προσδεμένες στον πρωτεινικό
κορμό τους. Σε αυτή τη μελέτη εξετάσαμε την επίδραση των ενδογενών και εξωγενώς
προστιθέμενων γλυκοζαμινογλυκάνων στη μιτογονική ικανότητα του PDGF-BB σε δύο
κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος (HT1080 και B6FS). Χρησιμοποιήθηκαν εξωγενώς
προστιθέμενες αλυσίδες θειικής χονδροιτίνης, θειικής δερματάνης, θειικής ηπαρίνης και
υαλουρονικό οξύ, ρυθμιστές της ενδογενούς παραγωγής γλυκοζαμινογλυκάνων (π.χ. β- Dxyloside/
sodium chlorate) και ειδικές γλυκοσιδάσες που κόβουν τις μεμβρανικές
γλυκοζαμινογλυκάνες. Ο PDGF-BB είχε μια σημαντική αύξηση στον ρυθμό ανάπτυξης των
κυτταρικών σειρών ινοσαρκώματος. Ταυτόχρονη χορήγηση αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης
και PDGF-BB είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της μιτογονικής δράσης του PDGF-BB
μέσω των PDGF υποδοχέων. Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση των αλυσίδων θειικής
χρονδροιτίνης στην επαγώμενη από τον PDGF-BB κινητικότητα των κυττάρων , την
χημειοταξία, την μετανάστευση και τη διήθηση των κυττάρων ινοσαρκώματος. Οι αλυσίδες
θειικής χονδροιτίνης επάγουν την επαγόμενη από τον PDGF-BB κινητικότητα των
κυττάρων , την χημειοταξία, την μετανάστευση και τη διήθητική τους ικανότητα μέσω της
αύξησης της φωσφορυλίωσης του PDGF Rβ υποδοχέα.
Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση των ενδογενών και εξωγενών αλυσίδων
θειικής χονδροιτίνης, θειικής δερματάνης, θειικής ηπαρίνης και υαλουρονικού οξέος στον
επαγώμενο απο τον PDGF-BB πολλαπλασιασμό, στην μετανάστευση και στην χημειοταξία
των φυσιολογικών ινοβλαστών DLF. Η εξωγενώς χορήγηση αλυσίδων θειικής χονδροιτίνης
είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης των ινοβλαστών. Όμοια ήταν τα
αποτελέσματα με την αύξηση της βιοσύνθεσης των αλυσίδων θειικής χονδροιτίνης μετά απο
χορήγηση β- D-xyloside. Ενώ, η αφαίρεση των ενδογενών αλυσίδων θειικής χονδροιτίνης
μετά τη χορήγηση χονδροιτινάσης ABC είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του επαγώμενου
από τον PDGF-BB ρυθμό ανάπτυξης, της χημειοταξίας και της μετανάστευση των
φυσιολογικών ινοβλαστών μέσω της μείωσης της φωσφορυλίωσης του PDGF Rβ υποδοχέα.
Ένα από τα πιο σημαντικά συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι η διαφορετική δράση των
πρωτεογλυκανών/αλυσίδων θειικής χρονδροιτίνης στον PDGF-BB ρυθμό ανάπτυξης, στη
χημειοταξία και στη μετανάστευση των φυσιολογικών ινοβλαστών και των κυττάρων
ινοσαρκώματος μέσω της μείωσης ή της αύξησης της φωσφορυλίωσης του PDGF Rβ
υποδοχέα, αντίστοιχα.
|
Βιοχημική και ανοσολογική μελέτη της δράσης των αυξητικών παραγόντων στη σύνθεση μεμβρανικών και εκκρινόμενων πρωτεογλυκανών σε κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος και φυσιολογικών ινοβλαστών
