| Περίληψη |
Οι πολυαμίνες σπερμιδίνη και σπερμίνη και ο υποχρεωτικός πρόδρομός τους, η πουτρεσκίνη, είναι μικρές αλειφατικές αμίνες που βρίσκονται σε όλα τα κύτταρα. Αν και ο ακριβής ρόλος τους και ο τρόπος δράσης τους δεν έχει, ακόμα, γίνει κατανοητός, πολυάριθμες μελέτες τις συνδέουν με ποικίλες φυσιολογικές διαδικασίες, που περιλαμβάνουν από την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση έως και την απόκριση σε συνθήκες καταπόνησης. Το αρχικό και καθοριστικό στάδιο της βιοσύνθεσης των πολυαμινών είναι η αποκαρβοξυλίωση της ορνιθίνης και της αργινίνης από τις ομώνυμες αποκαρβοξυλάσες, προς πουτρεσκίνη και αγματίνη, αντίστοιχα. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ρύθμιση της βιοσύνθεσής των πολυαμινών από την αποκαρβοξυλάση της αργινίνης (ADC), σε ένα πολυετές φυτικό είδος, την άμπελο (Vitis vinifera L.), το οποίο δεν αποκρίνεται σε in vitro μορφογενετικούς χειρισμούς. Η ADC της αμπέλου έχει άριστο pH στο 8,0, άριστο θερμοκρασίας στους 37 οC, απαιτεί την παρουσία σουλφυδρυλομάδων και φωσφορικής πυριδοξάλης αλλά όχι κάποιου μεταλλικού παράγοντα για την επίδειξη του μέγιστου της ενεργότητάς της και η αγματίνη και η πουτρεσκίνη παρεμποδίζουν την ενεργότητα της σε μεγάλες, σχετικά, συγκεντρώσεις. Η ενεργότητα της ήταν υψηλότερη στους μεταβολικά ενεργότερους ιστούς ενώ στις ρίζες ήταν η χαμηλότερη. Σε σπορόφυτα της αμπέλου η ενεργότητα της ADC ήταν μεγαλύτερη με την έναρξη του φυτρώματος και μειωνόταν με το χρόνο όπως συνέβαινε και στις κυτταροκαλλιέργειες και στους κάλλους αμέσως μετά την υποκαλλιέργεια. Η αμινοξική αλληλουχία ενός cDNA κλώνου της ADC που απομονώθηκε (EMBL, accession no X96791) αποτελείται από 630 αμινοξέα (λείπουν περίπου 100 αμινοξέα από το αμινοτελικό άκρο), φέρει τα χαρακτηριστικά πρότυπα της ομάδας ΙV των αποκαρβοξυλασών της Ορνιθίνης/ Dap/ Αργινίνης και εμφανίζει ταυτότητα 70-75% με τις αλληλουχίες της ADC των δικοτυλήδονων, 40% με την ADC της βρώμης και 30% με τις βακτηριακές ADCs. Ανάλυση κατά Southern έδειξε την ύπαρξη ενός γονιδίου ομόλογου με το cDNA που απομονώθηκε ενώ σε ανάλυση northern ολικού RNA από διάφορους ιστούς της αμπέλου εντοπίσθηκε ένα μετάγραφο, μεγέθους περίπου 3,1 kb, με διαφορετικό πρότυπο έκφρασης. Η in vitro ενεργότητα της ADC σε κυτταροκαλλιέργειες, αυξήθηκε με την προσθήκη αμμωνιακών και γλουταμίνης περισσότερο από ότι με την προσθήκη αργινίνης και γλουταμικού, δεν επηρεάσθηκε από τα νιτρικά, ενώ μειώθηκε με την πουτρεσκίνη. Ανάλυση northern έδειξε ότι καμία από τις παραπάνω επεμβάσεις δεν προκάλεσε αλλαγές στην ποσότητα του mRNA της. Αντίθετα, τα επίπεδα της ενδογενούς ελεύθερης πουτρεσκίνης και αργινίνης ακολούθησαν τις αλλαγές στην ενεργότητα της ADC. Αντίσωμα, που παρασκευάσθηκε εναντίον της ADC, αναγνωρίζει σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από διάφορους ιστούς κυρίως μία πρωτεϊνική ζώνη μεγέθους περίπου 80 kDa. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από φύλλα και βλαστούς αμπέλου, σε διαφορετικά οντογενετικά στάδια, παρουσίασαν διαφορές στην ποσότητα της πρωτεϊνικής ζώνης των 80 kDa χωρίς όμως οι διαφορές αυτές να ακολουθούν τις αλλαγές στην ειδική ενεργότητα της ADC. Επίσης, σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυτταροκαλλιεργειών, με μεγάλες διαφορές στην ενεργότητα της ADC, δεν ανιχνεύθηκαν ποσοτικές διαφορές στην πρωτεϊνική ζώνη των 80 kDa που να συμβαδίζουν με αυτές. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι οι αλλαγές στην ενεργότητα της ADC δεν οφείλονται σε επαγωγή ή καταστολή του γονιδίου της και επομένως η ρύθμιση της στην άμπελο γίνεται μετα-μεταγραφικά και πιθανώς μετα-μεταφραστικά όπως συμβαίνει και με άλλα ένζυμα της βιοσύνθεσης των πολυαμινών.
|
Μοριακός, και ανοδολογικός χαρακτηρισμός και ρύθμιση της έκφρασης της αποκαρβοξυλάσης της αργινίνης της αμπέλου (vitis vinifera L.)
